[发明专利]基于多重PCR捕获技术的杜氏/贝氏肌营养不良症的检测试剂盒及方法有效
申请号: | 201711470762.8 | 申请日: | 2017-12-29 |
公开(公告)号: | CN108220418B | 公开(公告)日: | 2018-11-09 |
发明(设计)人: | 糜庆丰;周幸芝;吕来灰;吴春求;朱鹏远;黄铨飞;王杨;陈雨;刘丽菲 | 申请(专利权)人: | 东莞博奥木华基因科技有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6883 | 分类号: | C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11 |
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地址: | 523808 广东省东莞市松山湖高新技*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 多重PCR 捕获 突变检测 引物组 突变检测试剂盒 肌营养不良症 检测灵敏度 内含子序列 高度一致 检测试剂 扩增效率 突变信息 内含子 外显子 一次性 杂合性 引物 突变 检测 重复 | ||
1.DMD基因多重PCR捕获引物组,所述引物组含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ IDNO:290所示的引物序列。
2.根据权利要求1所述的DMD基因多重PCR捕获引物组,其特征在于:所述引物组还含有捕获内参基因的引物序列。
3.根据权利要求1或2所述的DMD基因多重PCR捕获引物组,其特征在于:所述引物序列5’端还连接有测序平台建库所需的序列。
4.根据权利要求2所述的DMD基因多重PCR捕获引物组,其特征在于:内参基因选自GAPDH基因、β-actin基因、18s-rRNA基因。
5.DMD基因突变检测试剂盒,包括权利要求1~4任一项所述的DMD基因多重PCR捕获引物组。
6.DMD基因突变检测方法,所述方法用于非疾病诊断目的,包括:根据测序平台建库需求,利用权利要求1~4任一项所述的引物组构建扩增子文库,经文库质控、高通量测序和生物信息分析,获得DMD基因的突变信息,所述突变信息包括纯合性/杂合性的缺失/重复、点突变和未知突变。
7.根据权利要求6所述的DMD基因突变检测方法,其特征在于:所述方法进一步包括步骤:
(1)在权利要求1或2所述的引物序列5’端连接上通用序列作为引物组,用于捕获模板DNA的目标区域,获得多重PCR产物,对多重PCR产物进行纯化;
(2)利用P1接头、标签接头与多重PCR纯化产物进行第二次PCR扩增,对不同样品的第二次扩增产物进行混合和纯化,获得扩增子文库;
(3)扩增子文库质控、proton测序,对下机数据进行生物信息学分析。
8.根据权利要求7所述的DMD基因突变检测方法,其特征在于:引物混合比例按说明书中表1的引物pooling系数所示。
9.根据权利要求7所述的DMD基因突变检测方法,其特征在于:
任选地,步骤(1)中,10μL多重PCR的反应体系为:2X多重PCR缓冲液5μL、100μM primerpool 0.5μL、gDNA 10ng、Nuclease-free Water为余量;PCR反应程序:①95℃3~5min;②12~15个循环,每个循环:95℃30~45s、62℃1~3min、72℃30~45s;③72℃1~2min;④8~16℃保持;
任选地,步骤(2)中,25μL的第二次PCR扩增体系:2X建库PCR缓冲液12.5μL、标签接头0.5μL、P1接头0.5μL、多重PCR纯化产物11.5μL;PCR反应程序:①98℃3~5min;②23~26个循环,每个循环:98℃10~20s、60℃30s~2min、72℃20~40s;③72℃1~2min;④8~16℃保持。
10.根据权利要求7所述的DMD基因突变检测方法,其特征在于:
所述通用序列的核苷酸序列为:5’-AAATGGGCGGTAGGCTTG-3’;
所述P1接头:5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-通用序列-3';
标签接头:5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNGAT-通用序列-3’;序列中N表示AGCT任意碱基,NNNNNNNN用于识别不同样品构建的文库。
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