[发明专利]基于多重PCR捕获技术的杜氏/贝氏肌营养不良症的检测试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种DMD基因多重PCR捕获引物组、DMD基因突变检测试剂盒及DMD基因突变检测方法。发明人针对DMD基因的79个外显子和两侧50bp内含子序列以及23个已知内含子致病突变提供了一种多重PCR捕获引物，并且基于引物组提供了一种DMD基因突变检测方法，其检测灵敏度高，准确性好，扩增效率高度一致，对DNA样本质量要求低，解决了现有技术难以采用多重PCR捕获技术一次性进行完整的DMD基因突变信息检测，特别是对于杂合性缺失/重复。

技术领域

本发明属于基因测序领域，具体而言，涉及一种基于多重PCR目标序列捕获技术的杜氏/贝氏肌营养不良症的检测试剂盒及方法。

背景技术

杜氏/贝氏肌营养不良症是致死性X连锁隐性遗传病，根据进展程度不同可分为假肥大型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)即杜氏营养不良症和贝氏肌营养不良症(Becker muscular dystrophy,BMD)，两者互为等位基因临床异质性疾病。其中DMD的主要临床特征表现为进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大，同时累及呼吸肌和心肌，部分患者伴有智力障碍，患者从3-5岁起病，12岁左右失去行走能力，20多岁死亡，其在活产男婴中的发病率高达1/3500。与DMD相比，BMD发病年龄比DMD晚，进展速度慢，其发病率有报道为1/30000。总之，目前国内外尚缺乏对DMD/BMD特效的治疗方法，故只能通过对先证者的确诊和携带者筛查，然后进行专业的遗传咨询、婚育指导和产前诊断来杜绝DMD/BMD患儿的出生。

与DMD/BMD致病相关的编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的DMD基因定位于Xp21.2-21.3。大约有60-65％的DMD患儿是由于DMD基因外显子缺失所致，5-10％是由于DMD基因外显子重复所致，其余约30％是由于DMD基因微小突变导致。由于DMD基因的复杂性和突变类型的多样性，传统的DMD基因的突变检测方法如Southern杂交法(Southern blotting)、变性高效液相色谱法(Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)、多重连接依赖式探针扩增法(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)、微阵列-比较基因组杂交法(array comparative genomic hybridization，arrayCGH)等，均存在一些突出问题如只能检出部分突变类型和已知突变，检测通量低，检测周期长，而且检测准确率低；约30％患儿需要进行二次检测，大大增加了检测周期和检测成本。

随着新一代高通量目标序列捕获测序技术的发展，以Life Technologies公司IonPGM^TM/Proton^TM系列和Illumina公司的Hiseq和Miseq系列测序仪为代表，有着其他技术无可替代的高通量、低成本、检测变异类型全面和准确率高等优势，已被广泛的应用于各类生物学研究和医学检测。相比于探针捕获技术，应用多重PCR扩增进行目标序列捕获具有操作简单、成本低，短时间大量富集目标DNA序列等显著优势，大大缩短了检测流程和检测时间。因此，开发一种基于多重PCR捕获技术，并可快速、准确、一次性检测DMD基因所有突变(纯合/杂合性缺失、重复、点突变)的产品和方法，非常具有市场应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DMD基因多重PCR捕获引物组、DMD基因突变检测试剂盒及DMD基因突变检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

DMD基因多重PCR捕获引物组，所述引物组含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQID NO:290所示的引物序列。

作为上述引物组的优选，所述引物组还含有捕获内参基因的引物序列。

作为上述引物组的优选，所述引物序列5’端还连接有测序平台建库所需的序列。