[发明专利]检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法

权利要求书

1.一种检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL分别与10μL内标工作液和90ul空白血清或空白血浆混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，再分别加入含有甲醇的乙腈沉淀蛋白试剂300uL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，然后在10000-15000rpm的转速下高速离心，10-12min，得到至少三种标准溶液的上清液，使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对上述标准溶液的上清液进行检测，得出上述至少三种标准工作液和内标色谱图，在上述标准工作液和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为茶碱溶液，所述内标工作液为可可碱溶液；

(a)标准工作液的配制：

精确称取茶碱标准品20mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有1-1000μg/mL茶碱的范围内配置出各标准工作液；

(b)内标工作液的配制：

精确称取可可碱标准品1mg置于10mL容量瓶，用纯水溶解，并定容于10mL，得到内标工作液，并在-80℃条件下保存；

(二)检测血液的离心

取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得到血消或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；

(三)待测样品处理

(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入100μL步骤(二)中所述血清或血浆，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s-1min；

(d)用移液枪移取300uL的含有甲醇的乙腈沉淀蛋白试剂加入步骤(c)的离心管中，在1200-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min，然后在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，得到上清液即为待测样品；

(四)待测样品的检测

移取步骤(d)的待测样品上清液100uL，使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对上述待测样品上消液进行检测，得出上述待测的样品的茶碱和内标色谱图，在上述茶碱和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的茶碱药物浓度。

2.如权利要求1所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有茶碱的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有可可碱的浓度。

3.如权利要求2所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有10、20、40、80、160、200、400μg/mL浓度的茶碱溶液。

4.如权利要求3所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述沉淀蛋白试剂是含有0-30％体积甲醇的乙腈混合溶液。

5.如权利要求4所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为Agilent 1290 Infinity inline filter。

6.如权利要求4所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18。