[发明专利]脂肪酶突变体Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体TTL‑Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用。所述脂肪酶TTL突变体TTL‑Gly183Cys/Gly212Cys的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。突变体在80℃水浴5min后剩余酶活为46.2％，提高至亲本脂肪酶的2.52倍。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体TTL-Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用。

背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3)全称三酰基甘油酰水解酶，属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶不仅可以在油水界面上催化天然底物油脂水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸，而且在非水相体系中脂肪酶还可催化酸解、转酯和酯合成等反应。工业饲料用脂肪酶主要来源于微生物，微生物分泌的脂肪酶具有较广的作用pH值和作用温度。随着酶催化技术的不断推广，酶制剂的应用条件也越来越严格，如高温、强酸强碱等特殊条件。脂肪酶作为一种重要的酶种被广泛地应用到食品加工、饲料、洗涤、医药等领域。油脂加工和饲料制粒等工艺通常需在较高温度下进行，热稳定性差的脂肪酶在上述工艺中易失活变性，因此开发高热稳定性脂肪酶一直是学术和产业界努力的目标。

为了得到更优的酶制剂，一方面可以从自然界筛选合适的酶基因，另一个途经就是将现有产业化的酶蛋白通过分子生物学技术进行改造，以适应不同产业的需求。现今改造酶蛋白的策略主要有两个，其一是非理性设计，通过随机突变改造酶的基因，再根据特定的改造目的，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。此策略优点是无须深入研究酶的结构和作用机理，但需要极大的工作量去完成筛选，效率偏低。

有文献报道科学家从突尼斯南部火山地区分离得到一株嗜热裸足菌，其分泌脂肪酶具有较好的耐热性，70℃处理1h后剩余50％酶活。毕赤酵母培养条件简单、易于工业化生产且高效分泌表达外源蛋白，已成功表达多个外源源脂肪酶。本发明利用毕赤酵母高效分泌表达嗜热裸足菌来源的脂肪酶，并以嗜热裸足菌脂肪酶基于为模板，通过定点突变技术获得热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。

发明内容

本发明的目的在于提供高热稳定性的脂肪酶TTL。所述高热稳定性脂肪酶TTL，是由亲本脂肪酶TTL进行定点突变，获得的脂肪酶突变体。用于表达所述脂肪酶的突变体的表达载体为pPICZαA和pPIC9K；用于所述表达载体转化的宿主细胞是毕赤酵母X33和GS115。所述脂肪酶突变体为：TTL-Gly183Cys/Gly212Cys。

野生型的脂肪酶基因全长825个碱基(SEQ ID No.1)及其编码的274个氨基酸(SEQID No.2)

SEQ ID NO.1