[发明专利]一种三联灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 对猪流行性腹泻病毒生产种毒和猪轮状病毒生产种毒进行驯化；具体包括：采用连续适应方法--在动物细胞培养猪流行性腹泻或轮状病毒的过程中逐步降低胰酶的添加量，先将胰酶添加量减少50%，再将胰酶添加量减少25%，后按照1.0μg/mL的梯度进行递减，直到病毒不再依赖胰酶进行繁殖为止，挑选出不依赖胰酶的猪流行性腹泻和猪轮状病毒生产种毒；

b. 生物反应器微载体悬浮培养Vero、ST、Marc145三种动物细胞；其中，最佳浓度范围分别为：Vero细胞80~120万/mL、ST细胞80~120万/mL、Marc145细胞130~170万/mL；其中，所述生物反应器为德国赛多利斯BIOSTATR Cplus 10～120L原位灭菌型生物反应器；

c. 分别接种猪轮状病毒生产种毒、猪流行性腹泻病毒生产种毒、猪传染性胃肠炎病毒生产种毒；其中，在细胞培养48h后接种猪轮状病毒生产种毒，接种量为0.3~1.5%；细胞培养72h后接种猪流行性腹泻病毒生产种毒，接种量为1.0~5.0%；细胞培养96h后接种猪传染性胃肠炎病毒生产种毒，接种量为0.1~1.0%；

d. 收获病毒液，分别检测三种病毒效价均合格后，配制成疫苗；其中，

当细胞整体病变达到75%时收获病毒液；当猪流行性腹泻部分效价为每毫升猪流行性腹泻病毒含量≧ 10^8.5TCID₅₀ ，猪传染性胃肠炎部分效价为每毫升猪传染性胃肠炎病毒含量≧ 10^9.0TCID₅₀ ，猪轮状病毒部分效价为每毫升猪轮状病毒含量≧ 10^8.5TCID₅₀ 时方判定为合格。

2.根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤b中反应器微载体悬浮培养Vero、ST、Marc145三种动物细胞包括分别以不同的浓度梯度对三种动物细胞进行微载体悬浮培养，通过排列组合试验，筛选出三个毒株接种时对应的细胞密度最高的浓度组合。