[发明专利]一种三联灭活疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种三联灭活疫苗及其制备方法。具体包括以下步骤：对猪流行性腹泻病毒生产种毒和猪轮状病毒生产种毒进行驯化；生物反应器微载体悬浮培养Vero、ST、Marc145三种动物细胞；分别接种猪轮状病毒生产种毒、猪流行性腹泻生产种毒、猪传染性胃肠炎生产种毒；收获病毒液，分别检测三种病毒效价均合格后，配制成疫苗。本发明利用生物反应器微载体悬浮培养的方式同时培养三种动物细胞、同时接种三种病毒、制备了三联灭活疫苗，大大提高了生产效率，节约了能耗；本发明方案制备的三联灭活疫苗对猪仔有较长的免疫期限，相比较于三种疫苗单独免疫，对母猪保护率和仔猪被动免疫保护率明显提高，能够大大降低猪病毒性腹泻病的比例。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是指一种三联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻(PED)、猪传染性胃肠炎(TGE)和猪轮状病毒(RV)腹 泻是危害养猪生产的三个主要病毒性腹泻病，导致仔猪高死亡率、所有猪水样 腹泻，用任何抗生素和中西药药物治疗均无效。目前临床上很难区分这三种病， 而且有时呈混合性感染。

现用于猪流行性腹泻病毒培养的动物细胞有PK15、Vero；用于猪传染性 胃肠炎病毒培养的动物细胞有PK15、ST；用于猪轮状病毒培养的动物细胞有 Marc145、MA-104，可以看到培养三种病毒的细胞存在差异，但这些动物细胞 都可以使用DMEM或MEM培养基进行培养。涉及通过动物细胞培养的方式 生产的疫苗，大部分疫苗生产企业采用转瓶来培养动物细胞，不同转瓶是一个 独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，因此，生产 出来的疫苗不仅批次间差异大，而且操作劳动强度大，隐性污染易引起高内毒素。

目前在动物细胞培养猪流行性腹泻或轮状病毒的过程中添加7.5μg/mL～ 15μg/mL的胰酶是常规做法(见非专利文献1和2)，合适浓度的胰酶能够促 进病毒在动物细胞中的增殖速度，但是胰酶对动物细胞具有消化、分散作用， 限制了动物细胞生物反应器高密度培养。

非专利文献1：猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞中繁殖条件的优化， 当代畜禽养殖业，第3～4页，2014年11月。

非专利文献2：猪轮状病毒培养及人工感染研究，“环境与健康”学术研 讨会摘要集2007年。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种同时含有猪流行性腹泻病毒、猪传 染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒三种病毒的三联灭活疫苗及其制备方法。

一种三联灭活疫苗的制备方法包括以下步骤：

a.对猪流行性腹泻病毒生产种毒和猪轮状病毒生产种毒进行驯化；

b.生物反应器微载体悬浮培养Vero、ST、Marc145三种动物细胞；

c.分别接种猪轮状病毒生产种毒、猪流行性腹泻病毒生产种毒、猪传染性 胃肠炎病毒生产种毒；

d.收获病毒液，分别检测三种病毒效价均合格后，配制成疫苗。

其中，步骤a中对猪流行性腹泻病毒生产种毒和猪轮状病毒生产种毒进行 驯化包括采用连续适应方法--在动物细胞培养猪流行性腹泻或轮状病毒的过 程中逐步降低胰酶的添加量，直到病毒适应在不含胰酶的环境中繁殖为止；连 续适应性中先将胰酶添加量减少50％，再将胰酶添加量减少25％，后按照 1.0μg/mL的梯度进行递减，直到病毒不再依赖胰酶进行繁殖为止，挑选出不 依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒生产种毒和猪轮状病毒生产种毒。

步骤b中三种动物细胞分别以不同的浓度梯度进行微载体悬浮培养，通过 排列组合试验，筛选出三个毒株接种时分别对应的细胞密度最高的浓度组合； 三种细胞的最佳浓度范围分别为：Vero细胞80～120万/mL、ST细胞80～120 万/mL、Marc145细胞130～170万/mL。