[发明专利]一种CAR-T细胞的制备方法、制得的CAR-T细胞及其应用

权利要求书

1.一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+CD8+T淋巴细胞激活后培养扩增；

S2、携带CAR的重组慢病毒感染所述步骤S1处理后的T淋巴细胞，制得所述CAR-T细胞，其中，所述携带CAR的重组慢病毒中携带的CAR基因包含CD28胞内区和4-1BB胞内区，所述CD28胞内区和4-1BB胞内区的核苷酸序列分别如SEQ ID7和SEQ ID9所示。

2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，携带CAR的重组慢病毒感染T淋巴细胞时，添加Polybrene，所述Polybrene的添加浓度范围为5～10μg/ml。

3.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，病毒感染的时间为10～20天。

4.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：将所述步骤S1中的T淋巴细胞激活后第3天进行所述步骤S2。

5.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述重组慢病毒携带的CAR基因为CD19CAR基因，所述CD19CAR基因包含Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段或由上述片段组成，所述Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段由Leader基因片段、CD19scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段依次拼接而成，所述Leader基因片段、CD19scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段的核苷酸序列依次如SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID5、SEQ ID6、SEQID7、SEQ ID8、SEQ ID9和SEQ ID10所示。

6.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述重组慢病毒携带的CAR基因为EGFRvIII CAR基因，所述EGFRvIII CAR基因包含Leader-EGFRvIII scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段或由上述片段组成，所述Leader-EGFRvIII scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段由Leader基因片段、EGFRvIII scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段依次拼接而成，所述Leader基因片段、EGFRvIII scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段的核苷酸序列依次如SEQID2、SEQ ID4、SEQ ID5、SEQ ID6、SEQ ID7、SEQ ID8、SEQ ID9和SEQ ID10所示。

7.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的激活操作如下：在分离得到的CD3+CD8+T淋巴细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T淋巴细胞，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与T淋巴细胞的比例为1:1～3:1。

8.根据权利要求7所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的培养扩增操作如下：从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞后的第2天起，添加最终浓度为300～500IU/ml的重组人IL-2、最终浓度为5～8ng/ml的重组人IL-7和最终浓度为5～8ng/ml的重组人IL-15。