[发明专利]一种CAR-T细胞的制备方法、制得的CAR-T细胞及其应用

说明书

本发明公开了一种CAR‑T细胞的制备方法、制得的CAR‑T细胞及其应用，所述制备方法包括以下步骤：S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+CD8+T淋巴细胞激活后培养扩增；S2、携带CAR的重组慢病毒感染所述步骤S1处理后的T淋巴细胞，制得所述CAR‑T细胞，其中，所述携带CAR的重组慢病毒中携带的CAR基因包含CD28胞内区和4‑1BB胞内区，所述CD28胞内区和4‑1BB胞内区的核苷酸序列分别如SEQ ID7和SEQ ID9所示。本发明制备方法制得的CAR‑T细胞可广泛应用于多种癌症的治疗。与现有技术相比，本发明方法制备的CAR‑T细胞增殖率相比于常规方法得到了显著提高。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种嵌合抗原受体T淋巴细胞(ChimericAntigen Receptor T-cell，CAR-T)的制备方法、制得的CAR-T细胞及其应用。

背景技术

近10年来，免疫疗法在癌症治疗中展现出了巨大的潜力和前景，嵌合抗原受体T细胞疗法的出现是免疫治疗领域的一大突破性进展。1989年，Gross等首次提出构建特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(CAR-T)。CAR-T疗法是利用患者自身免疫细胞杀伤肿瘤细胞，是一种特异性杀伤肿瘤细胞的方法，该治疗方法通过提取患者外周血中的T淋巴细胞，再将提取的T淋巴细胞通过基因工程方法进行改造，改造后的T淋巴细胞具备强大的特异性识别肿瘤抗原的能力，将改造后的T淋巴细胞经体外扩增后回输到患者体内，对肿瘤细胞具有特异性杀伤力。与传统免疫疗法相比，CAR-T疗法在体外和临床试验中均已表现出了更好的靶向性和杀伤性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。

尽管如此，CAR-T疗法在多项肿瘤治疗研究中的效果仍存在差异，推测其原因之一是由于现有技术中制备的CAR-T细胞的增殖效率和存活持久性不同。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够确保增殖效率高的CAR-T细胞的制备方法、制得的CAR-T细胞及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+CD8+T淋巴细胞激活后培养扩增；

S2、携带CAR的重组慢病毒感染所述步骤S1处理后的T淋巴细胞，制得所述CAR-T细胞，其中，所述携带CAR的重组慢病毒中携带的CAR基因包含CD28胞内区和4-1BB胞内区，所述CD28胞内区和4-1BB胞内区的核苷酸序列分别如SEQ ID7和SEQ ID9所示。

本发明的有益效果在于：优化设计的CAR基因结构和序列有利于后期的表达和增殖，采用两个共刺激分子胞内区有助于促进CAR-T细胞的增殖；通过本发明方法制备CAR-T细胞增殖率相比于常规制备方法可提升75％以上。

本发明还包括通过上述方法制得的CAR-T细胞。

本发明还包括将上述CAR-T细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。

本发明的有益效果还在于：本发明CAR-T细胞应用前景广泛，将可广泛应用于各种治疗或预防癌症的药物中且具有良好的治疗或预防效果。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。

本发明最关键的构思在于：优化设计的CAR基因结构和序列有利于后期的翻译、表达和增殖，其中Leader序列有助于后期的翻译，采用两个共刺激分子胞内区有助于促进CAR-T细胞的增殖。

一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+CD8+T淋巴细胞激活后培养扩增；