[发明专利]一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物，其特征在于，在多粘类芽孢杆菌基因组的amyE位点整合来自多粘类芽孢杆菌的glnR基因，所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.权利要求1所述的耐铵固氮微生物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用引物glnR-amyE1和glnR-amyE2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1161 bp的amyE位点上游同源臂；

利用引物glnR-amyE5和glnR-amyE6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1017bp的amyE位点下游同源臂；

利用引物glnR-amyE3和glnR-amyE4，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长803 bp的片段；

用Tiangen胶回收试剂盒切胶回收以上3个片段；

（2）用BamHI和SalI酶切温敏型质粒pRN5101，得到酶切片段；

（3）用New England Biolabs Gibson assembly master mix 将回收纯化后的3个片段和酶切纯化后的pRN5101组装在一起，得到载体pROglnR；

（4）将载体pROglnR通过电击转化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR验证和测序确认得到同源双交换后的glnR过表达菌株WT/glnR；

其中，所述引物glnR-amyE1、glnR-amyE2、glnR-amyE3、glnR-amyE4、glnR-amyE5和glnR-amyE6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2~7所示。

3.SEQ ID NO.1所示的glnR基因在提高多粘类芽孢杆菌在高铵条件下固氮酶活性方面的应用，其特征在于，通过在多粘类芽孢杆菌基因组的amyE位点整合来自多粘类芽孢杆菌的glnR基因，提高多粘类芽孢杆菌在高铵条件下固氮酶活性，所述高铵条件为多粘类芽孢杆菌所处环境中NH₄⁺的浓度为100mM。