[发明专利]一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。所述耐铵固氮微生物为在类芽孢杆菌属菌株基因组的amyE位点整合来自多粘类芽孢杆菌的glnR基因，该耐铵固氮微生物在限铵和高铵条件下都能进行生物固氮，提高了类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下的固氮酶活性，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。

背景技术

氮素是植物生产中必需的最大元素。化学氮肥在保障我国粮食生产、蔬菜种植和果树栽培中起着十分重要的作用。但长期过量偏施化学氮肥，导致土壤酸化和盐渍化，土壤微生物活力下降，己成为农业可持续发展的一个重要制约因子。

固氮微生物在常温常压下，利用体内的固氮酶能将空气中的氮气还原成铵，供植物生长利用。但固氮效率受铵浓度的影响，即，在限铵或铵浓度低时固氮，铵浓度一般大于5mM以上抑制固氮。在贫瘠的土壤里，固氮微生物的固氮效率高，而在肥沃的土壤里，只生长但不固氮。因此，获得在高铵条件下固氮的微生物，在农业生产中具有重要的应用价值。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物，在微生物菌株基因组的amyE位点整合来自多粘类芽孢杆菌的 glnR基因，所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述微生物为固氮类芽孢杆菌属。

在本发明的具体实施方式中，采用多粘类芽孢杆菌作为代表，以说明本发明构建方法构建得到的突变株。

进一步地，本发明以多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) 为例，提供了所述耐铵固氮微生物的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用引物glnR-amyE1和glnR-amyE2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1161bp的amyE位点上游同源臂；

利用引物glnR-amyE5和glnR-amyE6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1017bp的amyE位点下游同源臂；

利用引物glnR-amyE3和glnR-amyE4，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长803bp的片段；

用Tiangen胶回收试剂盒切胶回收以上3个片段；

(2)用BamHI和SalI酶切温敏型质粒pRN5101，得到酶切片段；

(3)用Gibson assembly master mix(New England Biolabs)将回收纯化后的3个片段和酶切纯化后的pRN5101组装在一起，得到载体 pROglnR；

(4)将载体pROglnR通过电击转化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR验证和测序确认得到同源双交换后的glnR过表达菌株 WT/glnR；

其中，所述引物glnR-amyE1、glnR-amyE2、glnR-amyE3、 glnR-amyE4、glnR-amyE5和glnR-amyE6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～7所示。