[发明专利]判断基因组中目标基因拷贝数的方法

说明书

本发明公开了判断基因组中目标基因拷贝数的方法，用待测物种的基因组中一个已知拷贝数的基因作为内参基因A；构建一个基因片段ABm，其上含有相同拷贝数的A序列的突变片段Am和待检测目标基因B的突变片段Bm；调整浓度使体系中A和ABm的摩尔比接近1:1的水平，构建两个体系的PCR反应：分别用于扩增内参基因A和A的突变片段Am，以及用于扩增目标基因B和B的突变片段Bm，分析两个体系中A:Am的摩尔比值An和B:Bm的摩尔比值Bn，则待检测目标基因B的拷贝数N＝X*Bn/An。本发明通过加入内参基因的方式，利用简单的普通PCR技术，快速判断目标基因的拷贝数，方法巧妙，抗干扰能力强，结果稳定，成本低廉，分辨率高，是目标基因拷贝数鉴定的突破性方法。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及判断基因组中目标基因拷贝数的方法。

背景技术

转基因植物是拥有来自其他物种基因的植物,该基因变化过程现在一般是指通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物，如使植株具有抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等新特性。

在生产转基因植物中目标基因会随机的插入植物基因组中，插入拷贝数和位点都是随机的，在农杆菌介导的植物转基因中目标基因50％以上会以单拷贝的形式插入，而基因枪介导的植物转基因中目标基因则以多基因拷贝插入为主，但是在后期的应用和基因功能分析中，必须以单拷贝为实验材料，以保证实验结果的稳定可靠。所以，鉴定转基因拷贝数是转基因后期分析的一项必须工作。

目前，分析拷贝数的权威方法有southern blot，其实验技术要求高，成本高，放射性同位素危险性高，地高辛效果不理想；其他的方法有定量PCR，但是定量PCR方法并不准确，因为其最大差异分辨率至少需一倍以上，其结果的可信性不能达到100％。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种判断基因组中目标基因拷贝数的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

判断基因组中目标基因拷贝数的方法，用待测物种的基因组中一个已知拷贝数的基因作为内参基因A，记为拷贝数为X的内参基因A；

构建一个基因片段ABm，其上含有相同拷贝数的内参基因A序列的突变片段Am和待检测目标基因B的突变片段Bm；

在PCR体系中加入基因组模板和ABm，调整浓度使体系中A和ABm的摩尔比接近1:1的水平，构建两个体系的PCR反应：第一个体系中设计一对引物PA-F/PA-R用于扩增内参基因A和A的突变片段Am，第二个体系中设计一对引物PB-F/PB-R用于扩增目标基因B和B的突变片段Bm，两个体系中都用相同的混合的基因组和ABm片段的DNA作为模板，PA-F/PA-R的扩增产物为A/Am，PB-F/PB-R的扩增产物为B/Bm，分析两个体系中A:Am的摩尔比值An和B:Bm的摩尔比值Bn，则待检测目标基因B的拷贝数N＝X*Bn/An。

进一步的，所述的基因片段ABm为一个参比载体ABm或一个DNA片段ABm。

优选地，所述突变片段Am和突变片段Bm的四种碱基为均衡突变，突变位点数大于4个，且突变后的模板和突变前的模板具有相同的PCR扩增效率。

优选地，所述使体系中A和ABm的摩尔比接近1:1的方法为：通过计算基因组的大小和基因组模板的浓度，以及ABm的浓度和ABm所在的分子大小计算得到。

优选地，所述An和Bn的计算方法通过高通量测序或者一代测序方法得到。

优选地，采用一代测序方法得到An和Bn值的方法为：将两个PCR体系分别的扩增结果进行一代测序，将测序得到的峰值数据以及作为参比差异序列的同源序列一起提交给计算机程序进行比对，统计每个序列所有差异位点的平均强度，各序列平均信号强度的比值即代表了所述同源序列的数量比值；所述同源序列为A/Am序列或者B/Bm序列。