[发明专利]一种以赤藓红B为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法

权利要求书

1.一种以赤藓红B为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：

1)绘制△A和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线：

向10mL比色管中加入0.5mL一定浓度梯度的低分子壳聚糖标准溶液，加入0.2mL浓度为1％的增敏剂，1.0mL的BR缓冲溶液，以及4.0mL浓度为1.0×10^-4mol/L的赤藓红B溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，在室温中静置1小时后于紫外分光光度计上，在体系的最大褪色波长530nm处以水为参比测量吸光度；其中试剂空白记为A₀，含壳聚糖的溶液记为A，并计算△A＝A₀–A，建立△A与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立△A与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立△A与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；

2)10μg/mL的样品工作液的制备：称取一定量待检测样品的胶囊壳，使用冰醋酸溶解，并将其定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液；

3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)种检测方法绘制△A和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的△A和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；

4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在530nm处测定其吸光度值A，并计算△A＝A₀–A，将△A代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。

2.根据权利要求1所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述B-R缓冲溶液由0.04mol/L混合酸与0.2mol/LNaOH溶液按不同比例配制而成。

3.根据权利要求2所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述混合酸由正磷酸、冰乙酸和硼酸组成。

4.根据权利要求1所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述的BR缓冲溶液的pH为4.2。

5.根据权利要求1所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述增敏剂为聚乙烯醇，吐温20，吐温80或OP-10中的一种。

6.根据权利要求5所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，所述增敏剂为聚乙烯醇。

7.根据权利要求1所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，步骤1中溶液的加入顺序为首先加入壳聚糖标准溶液，其次加入聚乙烯醇溶液，再次加入BR缓冲溶液，最后加入赤藓红B溶液。

8.根据权利要求1所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，步骤1)标准曲线C1，C2与C3中壳聚糖的浓度范围为0.05μg/mL～1.50μg/mL。