[发明专利]一种以赤藓红B为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以赤藓红B为探针的褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，属于大分子检测领域。

背景技术

壳聚糖(CTS)化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，又称脱乙酰甲壳素，由2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖两类单糖组成，是甲壳类(虾、蟹)动物、昆虫的外骨骼的主要成分，壳聚糖在自然界中分布广泛，属于高分子绿色材料。最近几年，随着不断地研究，对于壳聚糖人们已经有了全新的认识。壳聚糖有控制胆固醇、抑制细菌活性等机能，在医药方面有着多方面的应用。另外，壳聚糖在食品领域也有着非凡的意义，其具有抗菌、抗氧化、保鲜等作用。随着对壳聚糖的深入了解，壳聚糖还具有保湿、提高肌肤免疫力等作用，因此在化妆品方面也有着广泛的应用。随着壳聚糖在医药，食品和化妆品等各个领域中越来越广泛的应用，其与人们生活及健康的联系也越来越密切，因此，壳聚糖的准确定量变得尤为重要，建立简便高效的方法测定壳聚糖含量有着重要的意义，这将进一步推进壳聚糖在各个领域的应用。

壳聚糖是由自然界广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到的。具有安全无毒的特性，因而在食品、化妆品、医药等领域已有了广泛应用。目前，测定壳聚糖的方法有分光光度法、荧光法、共振瑞利散射法、电化学法、高效液相法等。在分光光度法中，高珍贵等利用茜素红与壳聚糖在一定酸度条件下的特异性显色反应,其复合物吸光值与壳聚糖含量成线性关系，建立了一种具有高选择性和高灵敏度的简便快速测定壳聚糖的分光光度法,但其具有稳定性不好、专属性较差，测定的线性范围较窄，无法对壳聚糖及其衍生物进行区分等缺点。荧光法虽然具有抗干扰能力强、操作简单、稳定性高的特点，但对荧光条件要求较为严格，否则会对结果造成影响。共振瑞利散射法灵敏度高，但是对仪器要求严格，选择性也相对较差，难以应用于复杂体系中。电化学法中由于壳聚糖黏度较大，对其电位影响较大，因而限制了这方面的发展。而高效液相法成本较高，从经济上考虑实用性较低。

基于此，本发明提供一种简便、快速、灵敏度更高的新方法，即一种以赤藓红B为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量。

发明内容

为了克服现有技术中对于成品中壳聚糖的含量难以定量，操作技术繁琐的技术不足，本发明提供一种以赤藓红B为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，本发明利用壳聚糖在弱酸性条件下，与赤藓红B和聚乙烯醇结合形成较为稳定的三元缔合物，使其在一定波长中的吸收峰梯度下降，聚乙烯醇在其中作为稳定剂作用。用分光光度计在530nm处测定其吸光度较赤藓红B有明显降低，且吸光度的降低值与壳聚糖的浓度成正比，以此作为壳聚糖的定量基础，建立了测定壳聚糖的褪色分光光度法，本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，其具有试剂廉价，灵敏度高重现性好的优点，适合在实际应用中推广使用。

一种以赤藓红B为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：

1)绘制△A和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线:

向10mL比色管中加入0.5mL一定浓度梯度的低分子壳聚糖标准溶液，加入0.2mL浓度为1％的增敏剂，1.0mL的BR缓冲溶液，以及4.0mL浓度为1.0×10^-4mol/L的赤藓红B溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，在室温中静置1小时后于紫外分光光度计上，在体系的最大褪色波长530nm处以水为参比测量吸光度；其中试剂空白记为A₀，含壳聚糖的溶液记为A，并计算△A＝A₀–A，建立△A与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立△A与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立△A与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；

在最佳的实验条件下，考察该体系对不同分子量的壳聚糖的测定结果。分别考察了低分子量、中分子量和高分子量的壳聚糖。经过统计学分析，不同分子量的壳聚糖结果存在显著差异性，该方法测定壳聚糖含量受不同分子量的影响。

2)10μg/mL的样品工作液的制备：称取一定量待检测样品的胶囊壳，使用冰醋酸溶解并将其定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液；