[发明专利]一种多能干细胞及其分化的T细胞和应用

权利要求书

1.一种采用多能干细胞定向分化T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将Runx1和Hoxa9串联的表达载体通过基因重组整合到多能干细胞的Rosa26位点，并采用潮霉素B进行抗性筛选；

(2)将步骤(1)所述多能干细胞定向分化为造血干细胞前体细胞，具体为依次采用D0培养基、D2.5培养基、D3培养基、D4培养基、D5培养基、D6培养基和D7培养基培养，在第11天定向分化为造血干细胞前体细胞；

(3)将步骤(2)所述造血干细胞前体细胞与小鼠骨髓基质细胞OP9-DL1细胞共培养，采用强力霉素进行诱导，得到T谱系祖细胞；

(4)诱导步骤(3)所述T谱系祖细胞分化为TCRβ细胞和/或TCRγ/δ细胞；

其中，步骤(1)所述多能干细胞为基因编辑后的诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系；

所述D0培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4的基础分化培养基；

所述D2.5培养基为含有3-8ng/mL激活素A和3-8ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的基础分化培养基；

所述D3培养基为含有3-8ng/mL激活素A、3-8ng/mL骨形态发生蛋白4和3-8ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基；

所述D4培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4和3-8ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基；

所述D5培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4、3-8ng/mL血管内皮生长因子、10-30ng/mL重组小鼠白介素3、10-30ng/mL重组小鼠白介素6、10-30ng/mL重组小鼠干细胞因子、10-30ng/mL重组人促血小板生成素和10-30ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体的基础分化培养基；

所述D6培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4、3-8ng/mL血管内皮生长因子、10-30ng/mL重组小鼠白介素3、10-30ng/mL重组小鼠白介素6、10-30ng/mL重组小鼠干细胞因子、10-30ng/mL重组人促血小板生成素、10-30ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体和1-2μg/mL强力霉素的基础分化培养基；

所述D7培养基为含有10-30ng/mL重组小鼠白介素3、10-30ng/mL重组小鼠白介素6、10-30ng/mL重组小鼠干细胞因子、10-30ng/mL重组人促血小板生成素、10-30ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体和1-2μg/mL强力霉素的基础分化培养基；

所述基础分化培养基为含有10-20％胎牛血清、180-220μg/mL铁饱和转铁蛋白、4.5×10^-4M硫代甘油、1-3mM GlutaMAX^TM-I添加剂、0.4-0.6mM抗坏血酸的IMDM培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D0培养基为含有5ng/mL骨形态发生蛋白4的基础分化培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D2.5培养基为含有5ng/mL激活素A和5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的基础分化培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D3培养基为含有5ng/mL激活素A、5ng/mL骨形态发生蛋白4和5ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D4培养基为含有5ng/mL骨形态发生蛋白4和5ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D5培养基为含有5ng/mL骨形态发生蛋白4和5ng/mL血管内皮生长因子、20ng/mL重组小鼠白介素3、20ng/mL重组小鼠白介素6、20ng/mL重组小鼠干细胞因子、20ng/mL重组人促血小板生成素和20ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体的基础分化培养基。