[发明专利]一种合欢细胞的悬浮培养方法

权利要求书

1.一种合欢细胞的悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的合欢腋芽作为外植体，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净，在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用无菌水冲洗3～5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；

(2)合欢愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23～28℃下，暗培养10～15天，然后每天光照8～12小时、光照强度为1000～1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.1～1.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)0.5～2.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；

(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA 0.5～1.5mg/L、2，4-D1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；

(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的合欢单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.5～1.0mg/L、2，4-D 1.0～4.0mg/L、PVP(即聚乙烯吡咯烷酮)20～80mg/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；

(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15～25天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；

上述(3)、(4)、(5)步骤中合欢细胞的培养条件均为温度23～28℃，pH值5.8，每天光照6～12小时，光照强度为1000～1500lx，摇床转速为120r/min。

2.根据权利要求1所述的合欢细胞的悬浮培养方法，其特征在于：步骤(2)所述愈伤组织诱导培养基为添加6-BA0.5mg/L、2，4-D 1.0mg/L的MS固体基本培养基。

3.根据权利要求1所述的合欢细胞的悬浮培养方法，其特征在于：步骤(3)所述合欢细胞的预培养液体培养基为添加6-BA1.0mg/L、2、4-D 2.0mg/L的MS液体基本培养基，预培养时间为7天。

4.根据权利要求1所述的合欢细胞的悬浮培养方法，其特征在于：步骤(4)所述合欢细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.8mg/L、2，4-D 2.0mg/L、PVP 50mg/L的MS液体基本培养基,pH值为5.8、蔗糖30g/L，细胞团接种量是30g/L。