[发明专利]一种合欢细胞的悬浮培养方法

说明书

本发明公开了一种合欢细胞的悬浮培养方法，是取合欢腋芽作为外植体，进行表面消毒；然后将消毒后的外植体置于愈伤组织诱导培养基上，进行培养获得愈伤组织；再进行细胞预培养、细胞悬浮培养和细胞继代培养，获得大量的悬浮培养细胞。本发明通过对合欢进行细胞的悬浮培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的合欢细胞培养物，为合欢细胞悬浮培养生产次生代谢产物奠定了良好的基础。

(一)技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种合欢细胞的悬浮培养方法。

(二)背景技术

合欢(Albizia julibrissin Durazz.)是豆科合欢属多年生落叶乔木。在我国南北都有栽培，分布于华东、华南、西南以及辽宁、河北、河南、陕西等省。合欢既是重要的园林观赏植物，同时更是一种重要的药用植物，合欢的叶、花、皮均可入药，具有重要医药价值,其细胞组织内含有含木脂体糖甙、合欢皂甙等多种成分。研究表明，合欢组织细胞次生代谢物合欢皂甙等具有抗生育，抗过敏作用，合欢皮所含多糖具有抗肿瘤作用，《本草纲目》有记载用于治郁结胸闷、失眠、健忘作用，能安五脏，和心志，有较好的镇静安神作用，也有治疗神经衰弱的作用。

目前合欢主要采用播种繁殖,播种繁殖育苗周期很长，而扦插繁殖过程中，合欢容易遭受病毒的侵染而在扦插繁殖中传播病毒，从而使优良性状的遗传资源得不到保护，最重要的是受季节变化和耕地逐渐减少的影响，导致无法满足合欢的市场需求，因此迫切需要找到一种能安全、快速而大量生产合欢细胞培养物的途径和方法，而采用组织培养技术不仅能解决合欢品种的繁殖变异问题，还可以通过细胞培养大量生产合欢次生代谢产物。合欢的悬浮细胞系的建立目前还未见报道，在工业生产中，通过合欢细胞培养是获得合欢细胞次生代谢药物和提取药理活性因子的有效途径之一，而且可研究合欢生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对合欢的遗传育种具有特殊意义。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种合欢细胞的悬浮培养方法。

本发明采用的技术方案是：

一种合欢细胞的悬浮培养方法，所述方法按如下步骤进行：

(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的合欢腋芽作为外植体，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用无菌水冲洗3～5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；

(2)合欢愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23～28℃下，暗培养10～15天，然后每天光照8～12小时、光照强度为1000～1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.1～1.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)0.5～2.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；

(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA0.5～1.5mg/L、2，4-D 1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；

(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的合欢单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.5～1.0mg/L、2，4-D1.0～4.0mg/L、PVP(即聚乙烯吡咯烷酮)20～80mg/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；

(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15～25天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；