[发明专利]一种普利卡那肽的固相合成方法

权利要求书

1.一种普利卡那肽的固相合成方法，其特征在于：先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。

2.根据权利要求1所述的一种普利卡那肽的固相合成方法，其特征在于，其步骤是：

A、片段缩合成各类普利卡那肽中间体：

(1)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-

Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3的合成；

（2）利用树脂的假稀释效应完成R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-

Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12)- disulfide的合成，4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；

(3)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-

Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成；4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；

各类氨基酸保护基中：

R为Z、Boc、Cl-Z、Fmoc、oNBS、dNBS、Troc、Dts、pNZ、oNZ、NVOC、NPPOC、HFA、 Ddz、Bpoc、Nps、Nsc、Bsmoc、α-Nsmoc、ivDde、Fmoc* 、MTT、Alloc 其中任意一个；

R1为Meb、Mob、TRT、Tmob、Mmt、Xan、Pmbf、Bn、tBu、Fm、Dnpe、Fmoc、Acm、Phacm、StBu、Npys、Alloc其中任意一个；

R2为H、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb其中任意一个；

R3为H、OMe、Oet、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb、wang树脂、CTC树脂其中任意一个；

R4为Bn、cHx、tBu、Trt、TBDMS、Dmnb、Poc其中任意一个；

B、普利卡那肽粗肽的合成；

C、普利卡那肽的纯化和冻干。

3.根据权利要求1或2所述的普利卡那肽的固相合成方法，其特征如下：固相合成过程中用到的偶联体系为：

（1）、单一缩合剂：DIC、EDC、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯、TBTU、PyBOP、HBTU、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；

（2）二体系缩合剂：DIC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、EDC/ HOSu；

（3）环合试剂：哌啶/DMF、H2O2/DMF、I2/DMF、DMSO/DMF、H2O2/H2O、I2/ H2O、DMSO/ H2O。

4.根据权利要求1或2所述的普利卡那肽的固相合成方法，其特征在于：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-

Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成具体步骤如下：

（1）以Fmoc-Leu-OH为第一个氨基酸，与wang树脂或CTC树脂，涉及的树脂替代度优选从0.2mmol/g~1.8 mmol/g进行缩合形成Fmoc-Leu-树脂，然后通过逐个偶联氨基酸的方法，偶联完成10个氨基酸树脂；之后将液相方法合成的R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-R3采用木瓜蛋白酶直接偶联到肽树脂上，完成全保护肽树脂的合成；

（2）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-

Cys(1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12) ，disulfide的合成

采用4号位、12号位Mmt或者ACM保护的半胱氨酸，用不同浓度的TFA进行裂解，脱除Mmt或者ACM后，用DMSO、空气、双氧水等氧化剂中的一种或者组合物进行氧化成环，获得目标产品；

（3）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-

Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成

采用7号位、15号位TRT、Tmob、Pmbf或者ACM保护的半胱氨酸，用I2/DMF进行脱保护并同时进行氧化成二硫环，获得目标产品；

（4）H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-

Leu-OH-cyclic (4→12),(7→15)-bis(disulfide)的粗肽合成

采用不同比例的TFA进行裂解，质子捕获剂或保护基捕获剂选自：TIS、EDT、水、二甲硫醚、苯甲硫醚，TFA的比例大于90%。