[发明专利]水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法

权利要求书

1.一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳；

2)在超净工作台上，加入无菌水进行清洗；

3)弃水，倒入适量75％酒精，摇动搅拌，表面消毒1-3min；

4)弃酒精，加无菌水进行清洗；

5)弃水，加入1～3％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min；

6)弃1～3％NaClO，用无菌水清洗4-5次，每次停留1-2分钟；

7)倒去无菌水，用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干；

8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，18～28℃暗培养7天；

9)培养结束后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，转入继代培养基上，在相同条件下继代培养；以后每两周继代培养一次；挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织继代培养6-7d后，用于农杆菌转化受体。

2.根据权利要求1所述水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，所述步骤5)弃水，加入2％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min。

3.根据权利要求1所述水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，所述步骤8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿30粒，均匀摆放，20～25℃暗培养7天。

4.根据权利要求1所述水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，所述步骤8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，均匀摆放，22～24℃暗培养7天。

5.一种根癌农杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB平板上划线，28℃黑暗培养2d，用接种环挑取农杆菌单菌落，将其接种于新鲜的YEB液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养48h，然后将农杆菌加入含100umol/LAS的共培养基中，调整菌体浓度OD600至0.1-0.2左右，即为共培养转化的农杆菌悬浮液。

6.一种水稻愈伤组织与农杆菌的共培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织放入无菌的三角瓶中，加入农杆菌悬浮液，室温，120rpm条件下侵染20min；

侵染完成后静置10min，然后将愈伤组织转移至无菌的滤纸上吸去多余的农杆菌菌液，并在超净工作台里吹2-3h，直至表面无肉眼可见菌体；

然后将其转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上；

20℃条件下分别黑暗培养12h～48h。

7.根据权利要求6所述水稻愈伤组织与农杆菌的共培养方法，其特征在于，所述挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织放入无菌的三角瓶中，加入农杆菌悬浮液，需要保证有足够的菌液与材料接触。

8.根据权利要求6所述水稻愈伤组织与农杆菌的共培养方法，其特征在于，所述共培养基，为NB+100umol/LAS。

9.一种如权利要求1～4中任一项诱导培养的水稻成熟胚愈伤组织。

10.一种如权利要求5所述方法培养的根癌农杆菌。