[发明专利]水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法

说明书

本申请公开了一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法：1)选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳；2)在超净工作台上，加入无菌水进行清洗；3)弃水，倒入适量75％酒精，摇动搅拌，表面消毒1‑3min；4)弃酒精，加无菌水进行清洗；5)弃水，加入1～3％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20‑30min；6)弃1～3％NaClO，用无菌水清洗4‑5次，每次停留1‑2分钟；7)倒去无菌水，用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干。本发明方法通过改变培养温度和培养时间，缩短农杆菌介导转化水稻的进程，并提高了水稻愈伤组织的诱导率和转化率。

技术领域

本发明分子生物学组织培养和转基因技术交叉技术领域，特别涉及一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)不仅是主要的粮食作物也是单子叶植物基础研究的模式植物。随着世界人口的不断增长以及人们生活水平的提高，从而对水稻产量和品质提出了更高的要求。传统育种具有育种年限长，需连续自交才能选育出需要的优良性状已经很难满足需求，通过现代生物技术与传统育种技术相结合来提高水稻的产量和质量已成为今后主要的发展趋势。

随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。

水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG(polyethylene glycol)介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。

基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大(上限是16-20kb)，转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。

同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定(一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合)，整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以农杆菌介导转化法已成为转化单子叶植物的首选方法。

目前，在现有技术水稻愈伤组织诱导培养中，其培养温度为26℃培养9-12天，农杆菌介导转化水稻共培养的时间为2天，在愈伤组织诱导培养阶段采取低温处理培养时间长，水稻愈伤组织的出愈率和愈伤组织质量较差，愈伤组织的诱导率和转化率低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种农杆菌介导水稻遗传转化方法。本发明方法通过改变培养温度和培养时间，缩短农杆菌介导转化水稻的进程，并提高了水稻愈伤组织的诱导率和转化率。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，包括以下步骤：

1)选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳；

2)在超净工作台上，加入无菌水进行清洗；

3)弃水，倒入适量75％酒精，摇动搅拌，表面消毒1-3min；

4)弃酒精，加无菌水进行清洗；

5)弃水，加入1～3％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min；

6)弃1～3％NaClO，用无菌水清洗4-5次，每次停留1-2分钟；