[发明专利]一种水稻遗传工程不育系选育方法

权利要求书

1.一种水稻遗传工程不育系选育方法，其特征在，包括以下步骤：

A、DsRED基因表达盒的获得；

B、水稻EAT1基因表达盒的获得；

C、玉米致死基因ZMAA1的扩增；

D、玉米花粉特异性启动子Pg47的扩增；

E、各基因表达元件的连接。

2.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系选育方法，其特征在，所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：

第一步，将DsRED基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上；

第二步，将完整的水稻EAT1基因引入第一步中已经引入DsRED基因表达元件的pCAMBIA1300载体上；

第三步，将玉米致死基因ZMAA1连入到已经连有DsRED基因表达元件和水稻EAT1基因的pCAMBIA1300双元载体上；

第四步，将玉米花粉特异性启动pPG47连接到前三步已经连接上DsRED基因表达元件、水稻EAT1基因和玉米致死基因ZMAA1的复合载体上。

3.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系选育方法，其特征在，所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：

第一步，利用上下游引物中引入的EcoR1和Kpn1酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上EcoR1和Kpn1酶切位点，将DsRED基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上。

4.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系选育方法，其特征在，所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：

第二步，连接EAT1基因，利用上下游引物中引入的Smal和Sal1酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上的Smal和Sal1酶切位点，将完整的水稻EAT1基因引入第一步中已经引入DsRED基因表达元件的pCAMBIA1300载体上。

5.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系选育方法，其特征在，所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：

第三步，利用上下游都引入的Af12酶切位点，将玉米致死基因ZMAA1通过单酶切位点连入到已经连有DsRED基因表达元件和水稻EAT1基因的pCAMBIA1300双元载体上。

6.根据权利要求1所述水稻遗传工程不育系选育方法，其特征在，所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：

第四步，利用上下游引物中引入Kpn I和Sma I酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上的Kpn I和Sma I酶切位点，将玉米花粉特异性启动pPG47连接到前三步已经连接上DsRED基因表达元件、水稻EAT1基因和玉米致死基因ZMAA1的复合载体上。

7.一种基因表达元件的连接方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，将DsRED基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上；

第二步，将完整的水稻EAT1基因引入第一步中已经引入DsRED基因表达元件的pCAMBIA1300载体上；

第三步，将玉米致死基因ZMAA1连入到已经连有DsRED基因表达元件和水稻EAT1基因的pCAMBIA1300双元载体上；

第四步，将玉米花粉特异性启动pPG47连接到前三步已经连接上DsRED基因表达元件、水稻EAT1基因和玉米致死基因ZMAA1的复合载体上。

8.根据权利要求7所述基因表达元件的连接方法，其特征在，进一步包括：

第一步，利用上下游引物中引入的EcoR1和Kpn1酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上EcoR1和Kpn1酶切位点，将DsRED基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上。

9.一种如权利要求1～6中任一项所述方法选育的水稻不育系。

10.一种如权利要求1～8中任一项所述方法在水稻遗传育种中的应用。