[发明专利]一种水稻遗传工程不育系选育方法

说明书

本申请公开了一种水稻遗传工程不育系选育方法，包括以下步骤：A、DsRED基因表达盒的获得；B、水稻EAT1基因表达盒的获得；C、玉米致死基因ZMAA1的扩增；D、玉米花粉特异性启动子Pg47的扩增；E、各基因表达元件的连接。所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：第一步，将DsRED基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上；第二步，将完整的水稻EAT1基因引入第一步中已经引入DsRED基因表达元件的pCAMBIA1300载体上。本发明F1代杂合体在自交结实过程中遵循孟德尔分离定律，产生的后代既有能保持三连锁基因的杂合体，又有无育性的不育系。

技术领域

本发明涉及基因工程遗传育种学技术领域，特别涉及一种水稻遗传工程不育系选育方法。

背景技术

水稻是是世界上近一半的人口的主食，除可食用外，还可以酿酒、制糖和作为工业原料，人类对水稻的需求很大。多年来的生产实践表明，杂交水稻一般可比常规稻增产20％以上，因此杂交水稻彰显着巨大的增产潜力。

杂交水稻的发展依赖于杂交水稻不育系的培育。我国杂交水稻的研究始于上个世纪60年代，70年代开始大规模被种植。第一代杂交水稻是以核质互作雄性不育系为遗传工具的三系法，第二代杂交水稻是以光温敏雄性不育系为遗传工具的两系法，“三系法”和“两系法”杂交育种技术对粮食增产贡献巨大，但也存在问题。三系法中可利用的具有优良形状的父母本有限，配组不自由，野败保持系频率较低。

生产上现有的不育系间遗传差异小，杂交种育性稳定性不够，抵御逆境能力较差。而“两系法”中光温敏雄性不育系的育性受外界温度控制，易导致光温敏不育系自交结实，制种失败。因此开发新一代不育系对杂交水稻的发展至关重要。

水稻EAT1基因是bHLH转录因子中的一员，bHLH转录因子大部分参与花药绒毡层的发育或小孢子发育。花药绒毡层对花粉的生长发育至关重要，绒毡层分泌的胼胝质酶能够适时地分解花粉母细胞和四分体的胼胝质壁，以保证小孢子彼此分离。而水稻EAT1基因突变后会导致绒毡层细胞不能及时降解，程序性死亡延迟，从而绒毡层分泌的胼胝质酶影响到小孢子的发育和分离，最终表现为不育。

玉米ZMAA1基因编码α-淀粉酶，可催化水解多糖分子的α-1，4-D糖苷键。Pg47启动子是玉米花粉发育后期表达的特异性启动子。利用Pg47启动子来调控ZMAA1基因，可以水解花粉中的淀粉，从而使花粉不育。LTP2启动子是大麦(Hordeum vulgare L)胚乳特异性的启动子，通过它可以调控红色荧光蛋白基因(DsRed)在水稻胚乳中特异表达。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种水稻遗传工程不育系的选育方法。本发明将水稻普通核不育基因EAT1与玉米种的致死基因ZMAA1连锁，同时以红色荧光蛋白基因DsRED作为报告基因，对水稻eat1突变体进行基因改造，获得F1代杂合体。F1代杂合体在自交结实过程中遵循孟德尔分离定律，产生的后代既有能保持三连锁基因的杂合体，又有无育性的不育系。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻遗传工程不育系选育方法，包括以下步骤：

A、DsRED基因表达盒的获得；

B、水稻EAT1基因表达盒的获得；

C、玉米致死基因ZMAA1的扩增；

D、玉米花粉特异性启动子Pg47的扩增；

E、各基因表达元件的连接。

所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：

第一步，将DsRED基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上；

第二步，将完整的水稻EAT1基因引入第一步中已经引入DsRED基因表达元件的pCAMBIA1300载体上；