[发明专利]一种分离黄酮类成分的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种分离结构近似的黄酮类成分的方法，所述方法基于高效液相色谱法，所述结构近似的黄酮类成分至少包括紫云英苷和槲皮苷；色谱条件为：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％～0.5％(体积百分比)磷酸水溶液，采用梯度洗脱：0‑40min，7％～25％A，其余为B；40‑60min，25％～50％A，其余为B。该方法第一次实现了紫云英苷和槲皮苷的分离。本发明还提供上述方法在检测柿叶提取物中黄酮类成分中的应用，尤其是一种基于一测多评法测定柿叶提取物或其制剂中黄酮类成分含量中的应用。

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法分离结构近似的黄酮类成分的方法及其应用。

背景技术

黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核的一系列化合物，其具有广泛的生理活性，如抗氧化、抗炎、抗过敏、修复受损DNA等等。但是因为其母核结构相对简单，取代基类型比较有限，主要是羟基、甲氧基、糖基等，导致结构相近的黄酮类化合物即使借助高效液相系统也难以分离。例如金丝桃苷(结构式如1所示)、异槲皮苷(结构式如2所示)、槲皮苷(结构式如3所示)、紫云英苷(结构式如4所示)、杨梅素(结构式如5所示)、槲皮素(结构式如6所示)和山柰酚(结构式如7所示)；尤其是紫云英苷和槲皮苷在液相分析时容易造成混淆。

本发明人在研究中发现，紫云英苷(又称为黄芪苷)和槲皮苷如果以混合标准品的形式注入高效液相色谱仪，采用如下的色谱条件：

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脱：0-60min，10％～35％A，其余为B；紫外检测器，检测波长：360nm。

结果在保留时间27.3min左右仅出现了一个色谱峰(具体见图1A和图1B)。说明上述色谱条件无法实现紫云英苷和槲皮苷的分离。如果将上述条件应用于以黄酮类化合物为活性成分的中药材及其提取物和制剂的质量控制，则会造成检测结果不准确。因此，有必要对黄酮类化合物的高效液相色谱条件做进一步研究，使得各个相近似的成分能够实现分离，达到检测的要求。

另外，中药成分复杂、功效多的作用特点使得利用单一成分难以全面评价中药质量，因此多成分多指标的控制方式成为必然的趋势，但是这种质量控制方式却又带来了检测费用高昂和操作繁琐等问题(王智民，等. 一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志，2011，36(6)：657-658)。研究人员发现，不同物质之间在紫外检测器中的响应-浓度比的比值是一个常数，并将该常数定义为相对校正因子(罗祖良，等.相对校正因子在中药多指标测定中的应用研究进展[J].中草药，2012，43(7)：1448-1452)。在进行多指标质量评价时，以药材中某一典型组分(如有对照品供应者)为内标化合物，建立其他组分与该内标化合物之间的相对校正因子后，就可以通过该相对校正因子计算出其他组分的含量。这种只通过测定一个成分，实现同时对多个成分定量的方法命名为一测多评法。近年来，一测多评技术已成功运用于一些常见中药的多种成分含量测定中，如蓝天凤等报道了利用一测多评法测定丹参中4中丹参酮类成分(蓝天凤，等.一测多评法测定丹参中4种丹参酮类成分[J].中草药，2012，43(12)：2420-2423)。但是一测多评法测定的基础仍然是在适当的条件下能够使所检测的成分实现较好的分离。

柿叶为柿科植物柿(Diospyros kaki Thunb.)的叶，主要含有多种黄酮类化合物，具有止咳定喘，生津止渴，活血止血之功效。以单味柿叶的提取物加工制成的脑心清片有活血化瘀、通络的功效，用于脉络淤阻，眩晕头痛，肢体麻木，胸痹心痛，胸中憋闷，心悸气短；冠心病，脑动脉硬化症见上述症候者。现行《中国药典》脑心清片和柿叶提取物的含量测定项下仅采用HPLC测定经盐酸水解后的槲皮素和山柰酚两个苷元的总量作为质控指标，对脑心清片或其中间体(柿叶提取物)尚未建立完善的质量控制方法。