[发明专利]用于检测病毒性出血性败血病病毒的遗传突变的方法

说明书

本发明涉及一种通过使用特异性结合VHSV的非病毒体基因的PNA探针和通过分析PNA探针的熔解图形，来辨别病毒性出血性白血病病毒(VHSV)并鉴定其突变的方法。本方法在以下方面有效：简单、快速和准确地辨别感染性水生生物体疾病的病因病毒的突变，可以检测鱼是否被该病毒感染以及鉴定NV基因的突变。

技术领域

本发明涉及用于检测病毒性出血性败血病(VHSV)非病毒体(NV)基因中的突变的方法，并且更具体地涉及与VHSV的特定基因特异性结合的PNA探针，和通过分析PNA探针的熔解图形检测VHSV NV中的突变的方法。

背景技术

病毒性出血性败血病病毒(VHSV)是一种在鱼中导致病毒性出血性败血病(VHS)的病毒。VHSV感染与以下因素有关，包括鱼的种类、鱼身的大小和水温，并且通过从鱼到鱼的水平传播和从母体到卵的垂直传播来表征。

鲑科的鱼感染VHSH而表现出疾病的最佳水温约为8℃，并且韩国比目鱼在20℃～15℃或以下的温度被VHSV感染。韩国比目鱼的VHSH感染主要发生在从秋季至下一年春季的低水温时期，导致渔业工业的巨大损失。

据报道，在2001年从冬季至春季的低水温时期VHSV对韩国水产养殖的比目鱼造成损害。从2001年起，在每年相似时期观察到VHSV感染的症状。因此，VHSV感染被归类为一般病毒疾病。影响韩国比目鱼的病毒疾病包括VHSV、牙鲆弹状病毒(HIRRV)、水生双RNA病毒等。在这些病毒疾病中，VHSV对韩国比目鱼造成最大损害。此外，VHS为在水生生命疾病控制法案中提供的一种法定传染病。

在由VHSH产生的6个病毒蛋白质中，NV区域是唯一的非结构性蛋白质，其主要分布在比目鱼细胞的细胞质中。一些先前的研究揭示了NV蛋白质作为显示出VHS病理的致病性蛋白质起作用。

与此同时，用于突变检测的一般方法包括多种分析技术，其包括测序技术、聚合酶链式反应(PCR)技术和微阵列技术。在现有技术的基因测序方法中，根据基因扩增技术(PCR)的原理，添加dNTP和少量的ddNTP，并且在ddNTP随机结合的同时，聚合具有不同长度的DNA链，和在通过电泳分离DNA链时，根据其长度比对DNA链。然而，现在，使4种不同荧光染料附接于每种ddNTP，并且当ddNTP结合时，可以使用荧光检测器证实每个核苷酸序列的信息。该测序方法具有极高的准确性，但是需要相当大量的时间用于测序，并且外部条件，包括样品的混合和样品的浓度，在结果的分析中起不利作用。特别地，在紧急的情况中，时间的消耗可能是非常重要的变量。例如，在遗传突变频繁发生的RNA病毒的情况下，应该快速预测遗传突变，从而可在早期防止RNA病毒的扩散。然而，现有技术牵涉的问题在于不能快速检测这样的突变。

同时，近年来，已经积极地运用不是整个基因核苷酸序列而是位于整个基因核苷酸序列的特定区域或标志物(marker)的分析。特别地，已经开发并使用了能够容易地使用探针检测遗传突变的方法。然而，常规水解探针方法具有技术局限，在于其仅能够检测具有遗传信息的区域或标志物。另外，常规探针方法的技术局限如下。第一，它需要已知关于待构建的核苷酸序列的信息。第二，当构建的探针区域的核苷酸发生改变时，不能证实结果，从而不能得到结果。最后，应该将待检测的基因产物构建成具有小于100bp至200bp的长度，使得它对于先前已知的核苷酸序列进行低覆盖的验证。因此，除了测序系统之外的常规探针方法具有的问题在于，这些方法不分析基因核苷酸序列，而是仅能够对于先前已知的核苷酸序列进行低覆盖验证(存在或不存在区域或标志物)。

因此，本发明的发明人已经做出广泛的努力以有效地检测在水生生物体中引起传染性疾病的病毒性出血性败血病病毒(VHSV)的非病毒体(NV)基因中的突变，并且作为结果，已经发现了当比较具有与其附接的报告基团(reporter)和猝灭基团的探针的熔解模式与样品的熔解模式时，可以以快速和准确的方式确定样品间的核苷酸序列同一性，核苷酸序列突变的存在或不存在和核苷酸序列突变的位置，由此完成本发明。

发明内容

技术问题