[发明专利]利用相位移区块合成条码化序列及其用途

说明书

本文提供了用于生成相位移条码寡核苷酸的组合物和方法，用于下一代测序的文库构建。在一些情况中，条码寡核苷酸与颗粒或珠连接。具体而言，提供了条码寡核苷酸文库，各条码寡核苷酸包括可变区域(例如，条码区域)、通用区域(例如，限定区域)和相位移区域，其中，第一条码寡核苷酸的限定区域的第一核苷酸与第二条码寡核苷酸的限定区域的第一核苷酸错开1‑50个核苷酸。还提供了使用条码寡核苷酸文库进行测序的方法和试剂盒。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年1月12日提交的美国临时申请第62/277,783号的优先权，其通过引用全文纳入本文。

背景技术

下一代测序可以用于平行评估数百万个的DNA链的序列。例如，在亿明达公司(Illumina)的测序技术中，DNA的多个克隆簇在表面上形成，并且藉由合成的测序通过将簇DNA用作底物进行。在各测序循环中，在各条DNA链上平行评估一个新的碱基。因此，重要的是在合成步骤中明确地鉴定簇。如果流动池上的全部簇在相同的位置包含相同的碱基，那么软件不能够正确地区分碱基，并且测序质量可能会下降，或者测序运行可能会失败。当待测序的大部分DNA链的在相同位置具有相同碱基时，大部分的测序平台会遇到这样的技术问题。

对于一些应用，需要在测序前标记、标签化或条码化某些DNA分子。这意味着待测序的分子可以包含至少两个区域：(1)条码，和(2)捕获核苷酸。这通常需要具有大量不同的条码以及这些条码相同的拷贝。需要标记这样的DNA分子，其旨在与相同的条码组合在一起。相同的条码可以包括在不同的孔或管中，或者在其他情况中，它们可以与多个珠物理附连(link)。

创造条码和捕获核苷酸有许多不同的方法。例如，引物延伸可以用于合成。采用该方法，条码核苷酸可以具有至少两个区域：(1)用作条码的核苷酸，和(2)用作引发、杂交或连接位点的核苷酸。如此，使用构建区块(building block)，通过例如利用恒定，通用引发位点的连接、杂交或PCR将区块接合在一起，可以合成整个条码化区域。这些恒定，通用引发位点可能引起测序问题。例如，大部分的序列沿着DNA链的相同位置可以具有相同或几乎相同的核苷酸图案(序列)。在一些情况中，序列在各位置可能具有低多样性。

对于该问题的解决方案包括在测序运行中使用随机、非相关的序列，诸如Phix对照(亿明达)以提高跨簇的多样性。这将在各测序循环期间产生足够的变异，但是稀释了准确的样品并且降低了测序能力。

发明内容

在一方面，本文提供了条码寡核苷酸文库，各条码寡核苷酸包括可变区域(例如，条码区域)、通用(universal region)区域(例如，限定区域)和相位移(phase-shift)区域，其中，第一条码寡核苷酸限定区域的第一核苷酸与第二条码寡核苷酸限定区域的第一核苷酸错开(stagger)1-50个核苷酸。

条码寡核苷酸可以游离于溶液中或者附着于珠。条码核苷酸可以处于诸如孔、管或平板的分区(partition)中。在一些实施方式中，一个或多个条码寡核苷酸处于分区中。在一些情况中，不同的条码寡核苷酸存在于不同的分区，例如，不同的孔或不同的管。在一些实施方式中，各条码寡核苷酸处于分开的分区中。在其它一些实施方式中，各条码寡核苷酸与珠连接。珠可以是水凝胶珠、塑料珠、玻璃珠或金属珠。

在一些实施方式中，相位移区域是在通用区域之前(例如，5′方向)。在一些实施方式中，多个条码寡核苷酸各自的相位移区域基本独特，并且具有1-50个核苷酸的长度。

在一些情况中，通用区域在其3′末端与核苷酸序列附连。

多个条码寡核苷酸各自的可变区域可以基本独特，并且具有至少3个核苷酸的长度。在一些情况中，各条码寡核苷酸包括超过一个可变区域。多个条码寡核苷酸各自的通用区域可以基本相同，并且具有至少6个核苷酸的长度。在其它情况中，各条码寡核苷酸包括超过一个通用区域。