[发明专利]用于纯化纤维蛋白原的方法

说明书

本发明涉及一种用于纯化纤维蛋白原的方法，并且更具体地，涉及一种包括以下步骤的用于纯化纤维蛋白原的方法：(a)(第一甘氨酸沉淀)通过向其中添加甘氨酸直到甘氨酸浓度变为1.5‑2.5M，使在含有纤维蛋白原的溶液中含有的所述纤维蛋白原沉淀，去除上清液，然后获得沉淀物；(b)(第二甘氨酸沉淀)，通过在裂解缓冲液中裂解由步骤(a)中的第一甘氨酸沉淀获得的沉淀物而获得裂解溶液，通过向其中添加甘氨酸直到甘氨酸浓度变为0.2‑1.2M使所述裂解溶液沉淀，并且回收上清液；(c)(第三甘氨酸沉淀)通过向其中添加甘氨酸直到甘氨酸浓度变为1.5‑2.5M使步骤(b)的上清液沉淀，并且获得沉淀物；和(d)，通过在裂解缓冲液中裂解步骤(c)的沉淀物获得裂解溶液，和通过纳米过滤器在其上进行纳米过滤(NF)。根据本发明，用于纯化纤维蛋白原蛋白的新的方法，因为病原性的动物来源的组分(病毒)的流入基本被拦截而是一种非常安全的方法，因为可通过简单的方法纯化具有高产率的高纯度纤维蛋白原蛋白而是非常经济和有效的，并且因为与常规方法纯化的纤维蛋白原相比具有通过具有高纯度而增加局部作用的优点，而可以用于预防和治疗血液相关疾病，特别是血液凝固病症。

技术领域

本发明涉及一种用于纯化纤维蛋白原的方法，并且更具体地，涉及一种包括以下步骤的用于纯化纤维蛋白原的方法：(a)通过将甘氨酸添加到含有纤维蛋白原的溶液中使甘氨酸的浓度为1.5至2.5M而使该溶液中的纤维蛋白原沉淀，然后去除上清液，并回收沉淀物(第一甘氨酸沉淀)；(b)使步骤(a) 的第一甘氨酸沉淀的沉淀物溶解于溶解缓冲液中以获得溶液，通过向其中添加甘氨酸使甘氨酸浓度为0.2至1.2M而使所述溶液沉淀，和回收上清液(第二甘氨酸沉淀)；(c)通过向其中添加甘氨酸使甘氨酸浓度为1.5至2.5M而使步骤(b)的上清液沉淀，和回收沉淀(第三甘氨酸沉淀)；和(d)使步骤(c)的沉淀溶解于溶液缓冲液以获得溶液，并使用纳米过滤器使所述溶液经受纳米过滤(NF)。

背景技术

纤维蛋白原，也称为凝血因子I，在止血和伤口愈合中起关键作用。它是在肝脏中合成的糖蛋白，具有340kDa的表观分子量，并且由两个二聚体组成，两个二聚体中的每个由通过二硫桥连接的称为Aα、Bβ和γ的三对不相同多肽链构成。它以约150-400μg/ml的浓度在血流中循环。在血管损伤时，血小板被激活并形成栓。纤维蛋白原通过帮助交联活化的血小板而参与初期止血。

与此同时，开始凝血级联的活化。作为终点，通过藉由凝血酶蛋白水解释放纤维蛋白肽A和以更低速率蛋白水解释放纤维蛋白肽B，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白。将可溶纤维蛋白单体装配成双链扭曲的纤丝。随后，这些纤丝以横向方式排列，产生更粗的纤维。然后通过FXIIIa使这些纤维交联成纤维蛋白网络，其通过纤维蛋白与活化的血小板的相互作用稳定了血小板栓，产生稳定的凝块。

病症和缺乏

先天性无纤维蛋白原血症是一种罕见的出血病症，其中，患者由于纤维蛋白原的缺乏或功能失常而患有血液凝固不足。该病症可导致自发出血或在小的创伤后或在介入性程序过程中过度出血。

纤维蛋白原的获得性缺陷比先天性无纤维蛋白原血症更常见，并且可由血稀释或其他事件诸如手术、创伤、弥散性血管内凝血(DIC)或脓毒症过程中的失血诱导。

可以通过替代疗法静脉输注新鲜冷冻血浆或低温沉淀物，而将纤维蛋白原缺乏校正到血浆中约1.5-3g/l的正常纤维蛋白原水平。然而，这些治疗有将病原体例如病毒或朊病毒引入患者的风险，并且因此导致另外的病症。因此建议经过静脉应用病毒失活的纤维蛋白原组合物以安全的方式恢复生理水平的纤维蛋白原。

纤维蛋白原纯化

人血浆含有超过100种蛋白质的复杂混合物，纤维蛋白原占蛋白质总量的约2％。因此，纤维蛋白原的纯化和分离通常需要多个步骤，并且这些单独过程步骤的多种组合是可能的。