[发明专利]用于制备具有定义的糖基化模式抗体的方法

说明书

本披露涉及用于制备具有定义的糖基化模式的抗体，特别是具有以N‑乙酰葡糖胺为末端的聚糖的抗体的方法。本披露的抗体适用于将有效载荷与其轭合的过程。本披露还延伸至由本文披露的方法获得和可获得的分子、新颖分子和中间体，包含所述分子的组合物以及所述分子和组合物的用途，特别是在治疗中，例如在癌症治疗中的用途。

本披露涉及用于制备具有定义的糖基化模式的抗体，特别是具有以N-乙酰葡糖胺为末端的聚糖的抗体的方法。本披露的抗体适用于将有效载荷与其轭合的过程。本披露还延伸至由本文披露的方法获得和可获得的分子、新颖分子和中间体，包含所述分子的组合物以及所述分子和组合物的用途，特别是在治疗中，例如在癌症治疗中的用途。

背景技术

抗体已成为非常重要的治疗类别，这为患者的治疗提供了重大进展。2012年，最畅销的20种药物中有5种是抗体。轭合抗体可能形成第二代抗体产品的重要部分。

抗体制造相对复杂且昂贵。通常使用哺乳动物细胞系，例如CHO细胞系来表达抗体以确保正确的折叠和活性。

在CHO细胞中制造的抗体的翻译后修饰是糖基化。糖基化与抗体的免疫识别相关，并且可以影响给定抗体的免疫原性和其他性质，例如效应子功能。更重要的是，给定抗体的抗体糖基化可能不是均一的。这可以导致抗体的分子量落入与离散值相反的范围内。

逐渐提高了生物产品例如抗体的监管标准。在将来提供新抗体产品是必要的，其中糖基化是控制的或定义的。

因此，能够制造具有定义的糖基化模式的抗体将是有用的。更重要的是，如果可以控制糖基化的结构，则可以以适合的形式提供抗体用于进一步加工，例如将抗体与有效载荷轭合。

WO 2004/063344披露了通过用半乳糖苷酶处理将聚糖转化成G0形式(特定聚糖形式)的情况。该酶处理去除任何末端半乳糖糖残基并留下末端N-乙酰葡糖胺糖残基。因此，虽然理论上可以使用酶例如β-1,4半乳糖苷酶和其他酶例如EndoS来修饰抗体上的聚糖，但是这种方法存在若干困难。在商业制造规模上，某些问题比在实验室或研究规模上更为严重。对于在商业制造规模上进行的方法，可能难以确保足够量的纯活性酶。这是因为为了最佳活性，酶必须以适当折叠的天然构象表达。此外，酶需要在适当的条件下储存和运输，以确保保持活性。此外，使抗体经受切割酶(例如EndoS)，有可能干扰抗体的折叠和活性。即使可以管理这些方面，使抗体以商业规模经受制备型酶处理的步骤也会导致处理时间的增加，使用增加的材料和增加的工时，所有这些都会影响商品的成本。

因此，对于商业规模的抗体制造方法，不希望采用酶处理步骤来切割聚糖以提供均一的抗体产品。

此外，具有不需要修饰多肽或蛋白质的碱性氨基酸序列的位点特异性轭合方法将是有用的。

此外，避免在轭合反应中使用金属和无机催化剂将是有用的，因为这些催化剂可能变成在最终药物产品中难以去除的污染物。去除这些类型的污染物可能需要额外的纯化步骤，并且有时甚至在额外的纯化之后，难以将污染降低到足够低的水平，以满足监管机构的要求。

本发明人已经鉴定了一种方法，该方法不需要酶处理步骤，并且使用该方法可以不改变抗体的碱性氨基酸序列。此外，可以不依赖铜催化化学，而达到抗体与有效载荷轭合。

发明内容

因此，在一个方面，提供了一种方法，该方法包括从编码所述抗体的CHO糖基化突变细胞系中表达抗体，其中所述CHO细胞系突变，使得由细胞表达的抗体上的N-聚糖具有末端糖，该末端糖为N-乙酰基葡糖胺，例如其中由细胞表达的抗体上N-聚糖的所有末端糖残基都是N-乙酰基葡糖胺。

在一个实施例中，该细胞系是具有在相应的聚糖合成途径中有效的突变的凝集素抗性CHO突变细胞系或CHO细胞系，例如Lec3.2.8、Lec4.8、Lec4A.8、Lec8、Lec10.8、Lec19和Lec20，例如Lec3.2.8、Lec4.8、Lec4A.8、Lec8和Lec10.8。这些细胞系通常具有影响它们N-聚糖合成途径的突变，