[发明专利]诊断伴随过度细胞死亡的疾病的方法以及用于其实施的试剂盒

说明书

本发明涉及医学，具体涉及实验室诊断，并涉及伴随细胞死亡增加的疾病的诊断和用于其实施的试剂盒。从个体获得血浆样品，然后进行血浆中核酸的等温扩增。然后从反应混合物中纯化核酸，并通过实时聚合酶链式反应方法进行核酸定量分析。在测试中确定系数К，如(I)所示。其中，Ct为聚合酶链式反应阈值循环的值。然后将系数К与参考值进行比较，当系数К值小于参考值，则诊断为伴随细胞死亡增加的疾病。还提供了用于执行伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的试剂盒。本发明使得可以以高灵敏度在疾病的任何阶段(包括不存在临床症状的早期阶段)进行伴随细胞死亡增加的疾病的微创诊断。К＝C₁或或或其中

本发明涉及医学，特别涉及实验室诊断，它可用于诊断伴随细胞死亡增加的疾病。

人体血液具有与细胞无关并在血流中自由循环的核酸(NA)。这些NA似乎是细胞死亡(衰减)的结果，其与所有器官内的新细胞连续替换旧细胞相关。在健康人的血浆中，自由循环DNA(cfDNA，无细胞DNA)的浓度约为6ng/ml。一些疾病伴随着细胞死亡的增加，并因此伴随着患者血浆中的cfDNA浓度的增加。这些疾病的例子主要是肿瘤疾病以及一些肝脏疾病，特别是肝病[O.V.Zairayants等，病理解剖学，第1章，细胞和组织损伤和死亡.2012年，960页]。

恶性肿瘤生长通常伴随着细胞死亡的增加。恶性细胞主要通过坏死而死亡，在较小程度上通过细胞凋亡而死亡；细胞碎片进入血管。这就是为什么与健康个体相比，大多数肿瘤患者的血浆中的cfDNA浓度增加。已经证实肿瘤患者的cfDNA来源于恶性细胞[HuangZ.H.等.乳腺癌患者在诊断及随访期间血浆循环DNA的定量分析“Quantitative analysisof plasma circulating DNA at diagnosis and during follow-up of breast cancerpatients”.癌症通讯(Cancer Lett).2006,243：64-70]。此外，这种cfDNA可以在某些条件下诱导细胞的致癌性转化[Garcia-Olmo D.C.等.在结肠直肠癌患者的血浆中循环的无细胞核酸诱导易感的培养细胞的致癌性转化“Cell-free nucleic acids circulating inthe plasma of colorectal cancer patients induce the oncogenic transformationof susceptible cultured cells”.癌症研究.2010,70：560-567]。

癌细胞的能量代谢不同于健康细胞。在癌细胞中观察到无氧糖酵解增加以及线粒体DNA(mtDNA)的拷贝数随着不同癌症类型发生变化(8)。在前列腺癌和卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、某些类型的白血病、结肠癌、脑癌、颈癌和其他形式的癌症情况下发现mtDNA拷贝数增加。相反，在胃癌、肝癌、乳腺癌和其他形式的癌症情况下发现mtDNA拷贝数减少。许多因素如年龄、氧化应激、组织特异性和肿瘤生长程度都会影响mtDNA拷贝数[Meng S.等.人类癌症中线粒体DNA拷贝数的改变“Mitochondrial DNA copy number alterationin human cancers”.NAJ Med Sci.2013,6(1)：22-25.DOI：10.7156/najms.2013.0601022]。

基于mtDNA结构的分析，Mitomics公司[www.mitomicsinc.com]所用的肿瘤疾病诊断方法和用于方法实施的试剂盒，其包括缺失的突变是已知的。Mitomics公司最成熟的测试是前列腺癌(前列腺核心Mitomics测试，PCMT)的测试。检测灵敏度为85％，特异性为92％。该方法的缺点如下：侵入性，分析使用前列腺活检材料，这是一个痛苦的过程。为了获得上述灵敏度和特异性参数，需要重复的活组织检查。该公司继续致力于使用该方法诊断其他形式的癌症。