[发明专利]用于产生具有二触角N-聚糖的重组糖蛋白的细胞系、使用其的方法及重组糖蛋白

说明书

本发明涉及具有GnTIVa/b和/或GnTV表达降低的经遗传修饰的细胞系、用于使用所述细胞系产生具有三‑和/或四‑触角N‑聚糖数目减少的N‑聚糖的糖蛋白的方法，及相应的糖蛋白。

本发明涉及具有GnTIVa/b和/或GnTV表达降低的经遗传修饰的细胞系、用于使用所述细胞系产生具有三-和/或四-触角N-聚糖数目减少的N-聚糖的糖蛋白的方法，及相应的糖蛋白。

在过去几年中，治疗性蛋白的发展已经大大加速。然而，特别是对于复杂糖基化的蛋白质，可能难以获得具有有利糖基化模式的蛋白质。这通常导致次最优的药理学性质(诸如例如减少的血清半衰期或增加的免疫原性)。

产生重组糖蛋白的一个困难是由于翻译后修饰(特别是糖结构)中的变化导致的产物的潜在异质性。这可能导致不同生产批次之间的产物质量不一致。

糖基化是最常见的翻译后修饰。几乎所有的生物技术药物都需要被正确地糖基化以展现最佳的治疗效果。通常，糖基化是指糖类与蛋白表面的共价连接，其中糖类与天冬酰胺残基连接产生N-连接的聚糖(N-聚糖)，或与丝氨酸残基或苏氨酸残基连接产生O-连接的聚糖(O-聚糖)。由于附接的聚糖在单糖顺序、分支模式和长度(微观异质性)方面可能不同，所以糖基化模式在不同分子间可能是非常不同的。另外，并非所有糖基化位点都必须完全被占据(宏观异质性)。

糖基化影响例如蛋白质的溶解度、它们对蛋白质水解的抗性以及它们与其他蛋白质或蛋白质受体(诸如例如ASGPR(脱唾液酸糖蛋白受体))的结合行为，并因此影响血浆中糖蛋白的半衰期。

对于约50kDa以下的小尺寸蛋白质，清除主要经由肾发生。除了蛋白质的尺寸，蛋白质表面电荷也会影响肾脏清除，因为肾脏中高度带电的蛋白质的过滤减少了。对于大尺寸蛋白质，通过特异性和/或非特异性肝摄取的清除主要发生在肝脏中。特异性摄取介体的实例是ASGPR，其与具有末端半乳糖的非唾液酸化的N-连接的糖蛋白特异性结合。由于该受体的作用，与在它们的N-连接的聚糖上具有末端半乳糖残基的它们的非唾液酸化的对应物相比，具有覆盖相邻碳水化合物、半乳糖的末端唾液酸(N-乙酰神经氨酸；NeuAc)的糖蛋白具有高达100倍的增加的半衰期。其他受体与甘露糖、N-乙酰基-葡萄糖胺或岩藻糖特异性结合，并且从系统中清除具有这些末端糖类的糖蛋白。

从这个角度来看，由于它决定了治疗性蛋白的药代动力学性质，所以包括高度末端唾液酸化在内的天然或接近天然的N-糖基化模式对于治疗性蛋白是至关重要的。另外，在糖蛋白上具有适当键合的末端唾液酸降低了糖蛋白的免疫原性。

获得接近天然糖结构和高度唾液酸化的最重要的策略是在能够将哺乳动物样糖结构与蛋白质连接的哺乳动物细胞系(例如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞))中产生重组蛋白质。然而，非人哺乳动物细胞系通常缺乏所需的酶以催化唾液酸的2,6-键合，并因此只能催化2,3-键合。此外，除了唾液酸之外，它们还通常将N-羟乙酰基神经氨酸(NeuGc)与聚糖连接，所述聚糖是一种人类中不合成的糖并因此在注射时在人类中产生免疫原性。因此，更好的策略将是从如CAP细胞(来源于人羊水细胞)或HEK293细胞(来源于人胚胎肾细胞)的人类细胞系产生治疗性蛋白。然而，在发酵期间从人类细胞系分泌的治疗性蛋白的唾液酸化通常是不完全的。

因此，在哺乳动物细胞中的唾液酸转移酶(例如β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)或β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4))的额外表达可能有利于增加治疗性蛋白的唾液酸化并因此增加血清半衰期。有趣地是，人血清蛋白主要是2,6-唾液酸化的，并且通常只有三-和四-触角N-聚糖中的另外分支是2,3-唾液酸化的。在用牛ST6Gal1酶进行的体外研究中揭示了这一现象的原因。特别地，可以证明这种唾液酸转移酶将NeuAc非常低效地添加至N-聚糖的第三和第四分支，特别是至Galβ1→4GlcNAcβ1→6Manα1→6分支(图2)。与这些研究相一致的是，显示与ST3Gal4的表达相比，ST6Gal1的过表达导致复杂N-聚糖的较低程度的唾液酸化。