[发明专利]样品多重循环和原位成像的方法

说明书

本发明涉及一种通过多重循环对样品进行原位成像的方法，该方法能够以快速、高灵敏和可靠的方式通过同一样品上的多分子读数对各种分子靶标进行成像。本发明还涉及防止样品和成像试剂降解的成像缓冲液，其特别适用于本发明通过多重循环对样品进行原位成像的方法。

发明领域

本发明一般涉及通过多重循环(cycle multiplexing)对样品，特别是生物样品进行原位成像的领域。

发明背景

基于图像的样品分析测量技术受到可以在单个样品(例如组织样品)中同时观察到的分子测量数量(多重化程度)的限制。到目前为止，与其他高度多重技术相比，如单细胞测序或质量细胞计数法，这已经限制了大规模“组学”的这种分析方法的使用。因此，目前只有基于图像的方法可以揭示的基本空间细节正在被丢失。使用免疫荧光而不是经典免疫组化可以部分克服这个问题，但测量仍然限于最多4-5个同时分子读数。基于图像的多重(multiplexed)样品分析测量的主要限制是在单个样品中分离不同的信号，没有信号之间的串扰。例如，在荧光成像的情况下，在高度多重的多色标记实验中，光谱的重叠阻止了发射信号的清晰分离。此外，荧光团可能在高标记密度下表现出自猝灭行为，进一步限制了多个标记的同时应用。对基于免疫的方法的多重能力的另一个限制是要求每种第一抗体必须来自不同的动物物种，以确保用第二抗体进行特异性扩增和检测。这原则上可以通过直接免疫荧光克服，换句话说直接标记第一抗体，但是这种方法引起了其他问题，例如由于缺乏扩增而降低的特异性和较低的信号输出。

使用WO 2007/047450中所示的抗体混合方法，使用已经实现的免疫荧光进行多分子读数。尽管这种方法具有基于图像的优点，适用于组织切片并且能够在含有非特异性核酸酶的环境中使用，但同时检测的最大数量是有限的。将可量化的参考标准包括在测量过程中，如WO 2008/005464中所述，同时提高某些应用，如生物标志物蛋白的半定量评分中定量免疫组化读数的精确度，例如当应用于乳腺癌组织中人表皮生长因子2(HER2)表达的半定量评分时，由于将输出信号分成特定条带，可进一步限制多个同时读数的可能性。通过进行多重光谱可以实现具有原位成像的多重样品，其包括在同一样品上施加不同的染料，并从成像结果中提取单个染色图像，如EP 1131631中所述。该技术涉及从样品的每个像素收集光谱数据，计算生成来自每个单独染色的光谱并且在校正的色谱中显示各个结果。在允许多标记量化的同时，由于每个信号之间可能存在串扰，因此器件性能与平行染色的数量成反比。

在克服上述限制方面，免疫染色技术的最新进展是非常有希望的。这些技术利用多循环原位成像，其包括在通常的染色/成像步骤之后的染料灭活和/或抗体洗脱，以实现额外轮次的染色和成像。

这些方法包括每次图像采集后荧光染料的化学灭活(Gerdes等，2013，PNAS，110(29)，11982-11987)，通过依次使用特制的酸化高锰酸盐溶液用于连续染色循环的抗体-抗原键的非破坏性解离(WO2010/115089)，用各种不同的缓冲液进行连续抗体洗脱(Pirici等，2009，J.Histochem.Cytochem.，57(6)，567-575)，连续循环的肽探针接触和高温变性用于连续多靶检测(WO2009/11714)，使用变性和洗脱技术的结合进行反复染色和成像循环(Wahlby等，2002，细胞检测(Cytometry)，47(1)，32-41)，在每个重染色步骤之前用漂白进行多次连续染色循环(Friedenberger，2007，自然实验手册，2，2285-2294)，使用生物共轭量子点作为用于分子生物标志物的多重分析的生物标记(Schubert等，2006，自然生物技术24,1270-1278)，使用水溶性聚合物与多个目标靶分子形成键(Xing，2007，自然实验手册2，1552-1165)。

所有这些多循环原位成像方法都是重复的并具有以下优点：允许随后利用在相同物种中产生的第一抗体以及用于不同分子靶标的相同化学试剂或荧光团，并且理论上能够在同一组织切片上识别无限数量的不同目标。