[发明专利]β-内酰胺酶变体

说明书

本发明涉及一种具有β‑内酰胺酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的核酸序列。本发明的分离的多肽是VIM‑2变体，其具有改进的特性，如蛋白酶稳定性提高、在肠道介质中的稳定性提高、对一种或多种抗生素的活性提高、比活性提高和/或在宿主细胞中的产生提高。

技术领域

本发明涉及一种具有β-内酰胺酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的核酸序列。本发明的分离的多肽是属于VIM型亚组的亚类B1金属β-内酰胺酶，其具有改进的特性，如蛋白酶稳定性提高；内在稳定性如热稳定性提高；针对一种或多种β-内酰胺化合物如β-内酰胺抗生素的活性提高；和/或在宿主细胞中的产生提高。

背景技术

许多抗细菌产品，特别是抗生素可以用于治疗细菌感染。然而，抗生素不仅仅攻击感染部位处的病原体，而且还影响可能存在于健康受试者体内，特别是肠道中的正常细菌菌群。由抗生素引起的结肠共生菌群(也被称为结肠微生物群，其由来自超过500种菌种的超过十万亿个细菌构成)的改变可能会导致不良副作用，如抗性细菌的选择和抗性细菌的潜在定殖、破坏正常消化过程、肠被机会性肠道病原体如艰难梭菌(Clostridiumdifficile)定殖和感染、抗生素相关腹泻或与肠道生态失调相关的其它疾病。这些副作用可以通过给予能够降解肠中，更特别是回肠末端和结肠中的残留抗生素的酶来减少。这种方法尤其描述于WO2004/016248或US20050249716中。

然而，酶是对许多物理化学因素敏感的脆弱大分子，所述因素诸如引起它们降解的蛋白酶的存在、温度、离子强度、金属辅因子的可用性或螯合剂的存在。此外，具有提高的比活性的酶将是有利的以提高它们的效率和/或减少用于在有需要的患者中获得残留抗生素的有效降解所需的量。最后，获得这样的抗生素降解酶的提高的生产收率将是有利的。

发明内容

本发明提供了VIM-2金属β-内酰胺酶的新型变体。确切地说，本发明涉及一种具有β-内酰胺酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(其是没有其天然信号肽的野生型VIM-2的序列)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。本发明的多肽与野生型VIM-2酶相比具有一种或多种以下特性：(i)蛋白酶抗性，特别是消化蛋白酶抗性提高；(ii)稳定性，特别是热稳定性和/或在肠道介质中的稳定性提高；(iii)对β-内酰胺的作用谱改进(即所述变体能够水解更多数量的β-内酰胺化合物，特别是β-内酰胺抗生素)；(iv)对一种或多种β-内酰胺化合物(例如对一种或多种β-内酰胺抗生素)的酶活性提高，特别是体现为缩短的抗生素失活时间；以及(v)生产收率提高。更确切地说，本发明的多肽是在位置34以及选自位置22和130的至少一个位置处包含替换的VIM-2变体，其中所述位置对应于SEQ ID NO:1的VIM-2β-内酰胺酶的氨基酸位置。

在本发明的一个具体的实施方式中，所述多肽在位置22和34处、在位置34和130处、或在位置22、34以及130处包含替换。

本文还公开了一种VIM-2变体，所述VIM-2变体在选自位置22、34以及130的至少一个位置处包含替换，其中所述位置对应于SEQ ID NO:1的VIM-2β-内酰胺酶的氨基酸位置。

在本发明的一个具体的实施方式中，位置22处的替换是Q22H或Q22N。在另一个实施方式中，位置34处的替换是Q34R。在另一个实施方式中，位置130处的替换是E130D。