[发明专利]由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞

说明书

本发明涉及由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞。本发明还涉及通过所述方法产生的功能性β细胞和所述β细胞的用途。

技术领域

本发明涉及由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法。

背景技术

胰岛细胞移植已被用于治疗1型糖尿病患者，显示出优于胰岛素疗法的葡萄糖稳态，但是该疗法受到器官捐献的限制。诸如人胚胎干细胞(hESC)的人多能干细胞(hPSC)可以无限增殖并分化成包括β细胞(BC)在内的许多细胞类型，因此可以解决供体胰岛的短缺。在WO 2012/175633、WO 2014/033322和WO 2015/028614中已分别提供了在体外将hPSC分化成定形内胚层(DE)、胰腺内胚层(PE)细胞和内分泌祖细胞(EP)的方案。由hPSC体外制备葡萄糖响应性胰岛素分泌BC是具有挑战性的。大多数方案导致产生胰岛素的细胞不能重现BC的表型，因为这些细胞也共表达其他激素，如胰高血糖素，并且对葡萄糖刺激无响应。

Rezania，A.等人“Reversal of diabetes with insulin-producing cellsderiVed in Vitro from human pluripotent stem cells”Nature Biotechnology 32，1121-1133(2014)和Pagliuca，F.W.等人“Generation of Functional Human Pancreaticb Cells In Vitro”Cell 159(2)，428-439，2014年10月9日，报道了hESC在体外分化成胰岛素分泌细胞。使用静态温育研究，来自两组的细胞都对葡萄糖刺激敏感，显示葡萄糖刺激后胰岛素产量增加大约2倍。然而，这种响应无论是在质量上还是在数量上均与原代成体β细胞的响应不同。作为比较，据报道，人胰岛刺激指数为2至10或更高(Shapiro，J.A.M.等人，“Islet Transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus usinga glucocorticoid-free immunosuppressive regimen”New England JournalofMedicine 343，230-238，7月27日(2000年))。

所报道的干细胞衍生的BC在动态细胞灌注试验中也未能显示出对葡萄糖的胰岛素响应，因此相对于原代人BC其在功能上不成熟。

用于由hPSC衍生的内分泌祖细胞形成能够在动态细胞灌注试验中响应于葡萄糖的功能性成熟BC的有效方案是未知的。改进现有方案以生成全功能性成熟BC用于与人胰岛相似的更一致的细胞产物，以获得移植后的可预测结果以及对于体外筛选目的都是至关重要的。

发明内容

本发明涉及由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的改进的方法。本发明还涉及完全分化的葡萄糖响应性β细胞。本发明还涉及可通过本发明的方法获得的功能性成熟β细胞。本发明还涉及所述细胞的医学应用，尤其是在1型糖尿病的治疗上。本发明也可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。

附图说明

图1示出了筛选途径，其中未分化的人胚胎干细胞(hESC)分化成定形内胚层(DE)并重新接种在T75烧瓶中，在其中细胞进一步分化为胰腺内胚层(PE)和内分泌祖细胞(EP)。在EP阶段开始β细胞(BC)步骤1筛选，并持续4-7天，并通过对NKX6.1+/INS+/GCG-细胞数目的qICC监测和/或流式细胞术进行分析。在BC步骤1筛选结束时开始BC步骤2筛选，并在3D悬浮培养物中持续3-7天的时间，这是通过在BC步骤1结束时解离成单细胞并在定轨摇床上以50rpm重新聚集成簇而实现的。通过静态和/或动态GSIS、INS蛋白质含量、ICC和qPCR对细胞进行分析。

图2示出了化合物对通过流式细胞术(FC)测量的在BC步骤1第4天的INS+/NKX6.1+/GCG-表达的影响。