[发明专利]跟踪核酸靶标来源以用于核酸测序的方法和试剂盒

说明书

本公开提供了用于当核酸靶标断裂成更小片段时通过所述靶标的条形码标记来跟踪所述靶标来源的方法和试剂盒。通过克隆定位的核酸条形码模板在固体载体上体外捕获核酸靶标。可以以大规模并行方式同时处理数百万个核酸靶标而无需另外的分区。将这些捕获的靶标断裂成小片段，并且在每个片段上标记靶标特异性条形码序列作为它们的原始靶标的标识。这些核酸靶标跟踪方法可以用于全基因组测序和靶向测序这两者中的多种应用。

技术领域

本公开大体上涉及用于改进的核酸测序的方法和试剂盒。

背景技术

本发明属于基因组学的技术领域。更具体来说，本发明属于核酸测序的技术领域。核酸测序可以为多种多样的生物医学应用提供信息，所述生物医学应用包括诊断学、预后学、药物基因组学、以及法医生物学。测序可以利用基本低通量方法，包括马克萨姆-吉尔伯特测序(Maxam-Gilbert sequencing)(化学修饰的核苷酸)和桑格测序(Sangersequencing)(链终止)方法；或高通量下一代方法，包括大规模并行焦磷酸测序、边合成边测序、边连接边测序、半导体测序等。对于大部分的测序方法，在引入测序仪器中之前，需要处理样品，如核酸靶标。举例来说，可以将样品片段化、扩增或与标识物附连。独特的标识物常常用于标识特定样品的来源。大部分的测序方法产生相对短的测序读段(read)，长度从数十个碱基到数百个碱基不等，并且由于有限的测序读段长度而不能产生完整的单倍型相信息。

发明内容

本发明提供了用于当核酸靶标被断裂成更小段时通过条形码标记跟踪核酸靶标来源的方法和试剂盒。可以在固体载体(例如珠粒、微粒、载片、平板或流动池)上克隆扩增或克隆合成用作条形码的多个核酸序列。本发明中的条形码序列的设计允许产生数十亿个不同的条形码并且每个条形码序列含有用于提高测序准确度的特征。通过这些克隆定位的核酸条形码模板在固体载体上体外捕获具有或不具有修饰的核酸靶标。使用转座酶和可转座的DNA来促进核酸靶标的片段化和条形码标记。可以以大规模并行方式同时处理数百个、数千个或数百万个核酸靶标。所述靶标中的每个可以在开放的本体(bulk)反应中被一组独特的条形码局部捕获而无需另外的分区，如用孔、微孔、洞、管、斑点、纳米通道、液滴、乳液液滴、胶囊、或用于分隔样品的部分的任何其他合适的容器进行分区。可以将这些捕获的靶标断裂成更小的片段，并且靶标特异性条形码序列将被标记到每个片段上作为其原始靶标的标识。这些核酸靶标跟踪方法可以用于全基因组测序和靶向测序这两者中的多种应用。

本文提供的方法和试剂盒相对于现有方法，如Illumina公司的合成长读段和10xGenomics公司的连接读段，提供了若干优点。举例来说，本发明提供了数百万个至数十亿个或更多个条形码，这些条形码显著提高标记容量和特异性。条形码设计提供了减少来自长段相同类型的核苷酸，即均聚物序列的测序错误并且滤出低质量读段的特征，以使它提高测序质量。可以使用已知的化学方法(例如乳液PCR方法、桥式PCR)在固体表面上直接克隆合成或克隆或半克隆扩增条形码。基于转座酶的片段化方法简化了样品制备程序。不同于所有的现有方法，本发明中的条形码标记反应可以在开放的本体溶液中进行，而无需用孔、微孔、洞、管、斑点、纳米通道、液滴、乳液液滴、胶囊进行另外的分区。所述程序容易自动化或按比例放大以用于高通量样品制备。本发明提供了条形码标记方法，所述方法不仅用于长核酸样品以用于诸如单倍型定相、结构变异检测以及拷贝数研究的应用，而且还用于短核酸样品以跟踪样品的独特性。

附图说明

图1是示出了条形码序列结构和组成的实例的表。

图2说明了核酸条形码模板。

图3示出了两种不同的可转座的DNA设计，(A)具有一体的3'突出端的转座子互补链，(B)具有分开的互补接头寡核苷酸的转座子互补链。

图4说明了通过杂交(A)和连接(B)在固体载体上捕获具有互补的3'突出端的转座子或转座体。

图5说明了通过杂交(A)和连接(B)在固体载体上捕获具有互补接头寡核苷酸设计的转座子或转座体。