[发明专利]靶分析物的亚细胞定位

说明书

本发明提供了通过使用至少两种透化试剂来确定和定量细胞样品中分析物的亚细胞定位的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2016年3月18日的美国临时申请No.62/310,595的优先权，该临时申请的内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及用于细胞样品中靶分析物的亚细胞检测和分析的方法、制品和组合物。

背景技术

通过流式细胞术对细胞内标记物的分析依赖于每个细胞内存在的每种染色或荧光标记物所发射的绝对信号的测量。这些数据不赋予此类信号的亚细胞定位，并且使用户通过染色或靶分子(如果有的话)的现有知识来推断定位。例如，当分析可活化蛋白质(诸如转录因子)的活化时，传统流式细胞术唯一存在的方法是分析其磷酸化或其他修饰的水平，并且假设该信息与最终的核定位相关。

分析这些分子中的任一个时的重要因素是它们是否实际存在或转位到细胞核中。在一些情况下，诸如对于信号转导子及转录活化子(STAT)家族的成员，该信息可能是相当准确的，因为STAT一旦磷酸化便立即转位到细胞核中。然而，情况并非总是如此，因为细胞信号传导通常非常复杂，并且大多数蛋白质在转位到细胞核中之前需要一组迂回事件。还可能需要附加活化步骤以在细胞核内启动一次转录修饰。

另外，任何仅依赖于修饰状态而没有关于亚细胞定位的信息的方法受到各种问题的阻碍，包括：1)对此类修饰有用的抗体的必要性；2)事实上，对于每一种蛋白质/分子存在许多不同类型的修饰，所述修饰都需要它们自身可能不存在的抗体(例如，磷酸化、氨基甲酰化、甲基化，乙酰化、磺化、亚硝基化、遍在蛋白化等)；3)事实上，对于大多数蛋白质/分子实际上并未识别大多数修饰；4)修饰状态的短暂性质，这不一定直接与蛋白质随时间推移的亚细胞定位或与蛋白质表达水平本身相关(即，不再被修饰的蛋白质仍可存在并且在靶区室内起作用)；5)用于评估此类修饰的透化试剂盒的兼容性；6)以及要求被分析的分子表面上存在修饰或此类修饰的生物化学暴露，以便使抗体能够接近染色的修饰。实际上，虽然磷酸化与STAT家族的核转位的诱导完全相关，但后者的问题使得除了市场上最苛刻的固定/透化试剂盒之外的所有试剂盒都无法评估STAT磷酸化，这通常由于其苛刻性而对检测其他蛋白质有问题。

通过使用细胞通过细胞仪时的低至中等分辨率显微镜图像，成像流式细胞术已被用于视觉评估蛋白质的亚细胞定位。作为另外一种选择，细胞已被纯化，然后通过传统显微镜检查、生物化学细胞亚分级分离后蛋白质溶解物的蛋白质印迹、或其他分子生物化学方法进行分析。

这些现有技术方法都有缺点。成像流式细胞术需要昂贵的仪器。它也主要是定性的，并且因为它拍摄三维细胞的二维图像，所以可能无法有效区分位于图像中的细胞核前面或后面的区室内的核周蛋白质或蛋白质的细胞质与核定位。类似地，传统显微镜工作良好，但主要是定性的并且难以解析核周蛋白质的三维定位。更先进的显微技术(诸如共焦显微镜)主要通过拍摄细胞的许多图像切片来解决该问题，然后允许将它们重建成三维图像；然而，这些显微镜比图像细胞仪昂贵得多，并且它们与粘附到显微镜载片的细胞一起工作效果最佳。此外，即使用最先进的显微镜，仍然难以辨别核周膜结合蛋白质是位于核膜内部还是外部。

分子生物化学技术的主要缺点是处理和制备蛋白质提取物以供分析所需的时间和精力，对于大多数技术(包括蛋白质印迹)这可能花费数天。此外，显微镜和分子生物化学技术在用于分析复杂样品(诸如全血)时共同的主要缺点是必须首先纯化靶细胞群，然后在进一步的实验和分析之前休息、培养并且可能扩增细胞持续数天至数周。

本发明解决了用于检测靶分析物(诸如可活化蛋白质)的亚细胞定位的现有技术方法的这些和其他缺点。

发明内容