[发明专利]AKT-mTOR通路蛋白的检测和量化

权利要求书

1.一种用于检测AKT-mTOR通路蛋白的方法，其包括：

a.从生物样品分离AKT-mTOR通路蛋白；

b.分解所述分离的蛋白质；

c.经质谱分析所述分解的蛋白质，以确定存在用于AKT-mTOR通路蛋白的肽，其中所述用于AKT-mTOR通路蛋白的肽选自由SEQ ID No: 16, 37, 42, 73, 80, 91, 96, 98, 157,163, 195, 200, 204, 208和209组成的群组；以及

d.检测所述样品中的一种或多种AKT-mTOR通路蛋白，

其中步骤a的分离包括：

用选自表8和表9的一种以上的抗体处理所述生物样品，其中所述表8的抗体鉴定非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白，所述表9的抗体检测磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白，且所述抗体免疫沉淀来自生物样品的AKT-mTOR通路蛋白；

其中所述表8如下：

所述表9如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其另外包括确定所述AKT-mTOR通路蛋白的数量。

3.根据前述权利要求1或2中任一项所述的方法，其中检测下限为在0.05至0.25 fmol的范围内，和/或其中定量下限为0.05至0.75 fmol的范围内。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述AKT-mTOR通路蛋白为磷酸化的。

5.一种用于确定磷酸化的与非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的比率的方法，其包括

a.用选自表9的一种或多种能够免疫沉淀磷酸化的AKT-mTOR靶蛋白质的抗体处理生物样品，并用选自表8一种或多种能够免疫沉淀非磷酸化的AKT-mTOR靶蛋白质的抗体分别处理相同的所述生物样品；

b.分解所述免疫沉淀的AKT-mTOR通路蛋白；

c.将已知量的可检测地标记的第一和第二内部标准肽添加至所述分解的蛋白质中，其中所述第一内部标准肽具有与用于鉴定所述磷酸化的蛋白的磷酸化的AKT-mTOR通路肽相同的氨基酸序列，并且所述第二内部标准肽具有与用于鉴定所述非磷酸化的蛋白的非磷酸化的AKT-mTOR通路肽相同的氨基酸序列；

d.经质谱分析所述分解的蛋白质和所述内部标准品，以确定所述磷酸化的和非磷酸化的AKT-mTOR通路肽的存在和数量，其中所述AKT-mTOR通路肽选自由SEQ ID No: 16, 37,42, 73, 80, 91, 96, 98, 157, 163, 195, 200, 204, 208和209组成的群组；以及

e.确定所述样品中所述磷酸化的和非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的数量，并且确定磷酸化的与非磷酸化的靶蛋白质的比率，

其中所述表8如下：

所述表9如下：

。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述生物样品为人，为分离的细胞、血浆、血清、全血、CSF、尿、痰、组织或肿瘤组织。

7.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述肽被可检测的标记修饰，所述可检测的标记包括选自13C、15N、2H以及18O的同位素。

8.根据权利要求1或5所述的方法，其中第一种所述抗体能够免疫沉淀磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白，第二种所述抗体能够免疫沉淀通过第一种所述抗体沉淀的非磷酸化形式的AKT-mTOR通路蛋白。

9.根据权利要求1或5所述的方法，其中步骤a）包括用能够结合通路蛋白的标记的抗体处理所述样品，以提供标记的抗体-蛋白质缀合物；并且使所述标记的抗体-蛋白质缀合物结合能够结合标记的抗体的捕获试剂，以从所述样品分离靶蛋白质，所述标记是生物素并且所述捕获试剂是链霉亲和素。