[发明专利]鉴定和分析蛋白的氨基酸序列的方法

说明书

本公开内容提供用于测定受试蛋白相对于靶标生物制品的生物相似性的方法，其中受试蛋白被两种不同的蛋白酶消化，得到的消化肽片段用柱色谱‑串联质谱分析，以达到受试蛋白的100%的氨基酸序列覆盖度和100%的氨基酸序列精确性。

相关申请

本申请要求2016年2月4日提交的美国专利申请号62/291,216的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

序列表的结合

命名为“ONBI-008001WO_SeqList.txt”的文本文件(创建于2017年2月2日且大小为81.7 KB)的内容通过引用以其整体并入本文。

公开内容的领域

本公开内容主要涉及：改进的蛋白测序方法，其使用减少的孵育时间用于变性蛋白的蛋白酶消化，并包括在柱色谱和串联质谱(LC-MS/MS)分析期间增加的含水流动相，以提高序列覆盖度和精确性至100%；以及改进的蛋白测序方法，其用于治疗性重组蛋白的开发和经批准的生物制品生产的质量控制分析。

背景

包括重组单克隆抗体(mAb)和天然蛋白的重组版本在内的重组蛋白已被用作生物医学研究的试剂，以及用于人的诊断剂和治疗剂。重组蛋白的一个实例包括生物相似分子(也称为“生物制品”)。为了被批准用作人的治疗剂，必须证明生物相似分子具有相同的氨基酸序列，并且在翻译后的修饰方面与亲本创新生物产品是非常密切地相似的，例如，具有“一致性(sameness)”。评估生物相似分子的一致性是至关重要的，因为重组蛋白本质上是复杂的。重组蛋白是利用遗传修饰的活生物体(例如细菌、酵母、动物或人细胞系)改造的。活生物体产生作为通过复杂机制折叠的长链氨基酸和/或修饰氨基酸的重组蛋白。因此，重组蛋白显示出高分子复杂性且对生产过程的变化是高度敏感的。

重组蛋白的特异性和效应子功能高度依赖于氨基酸序列和是否存在特定的修饰。因此，DNA测序通常用于初步表征生物制品，例如单克隆抗体。然而，重组蛋白(例如单克隆抗体)的蛋白-水平重排例如随后的突变和翻译后修饰(PTM)通过蛋白水平的分析而识别，因为这样的重排只能通过蛋白水平分析来揭示。因此，当抗体的cDNA或原始细胞系不可用时，或当氨基酸序列的表征是必要的，以验证经批准用作治疗剂的重组抗体的相似性，以及用于生产过程的质量控制时，需要单克隆抗体的氨基酸测序。

尽管蛋白中氨基酸的序列鉴定的重要性，但是目前还没有开发出提供高水平(100%)的序列精确性和覆盖度的未知蛋白测序方法。尤其测序重组蛋白仍是一个挑战。两种通用方法用于使用质谱对蛋白进行测序。在第一种方法中，完整的蛋白被电离，然后被导入质量分析仪用于质量测量和串联质谱(MS/MS)分析。这种方法被称为“自上而下的”蛋白组学。在第二种方法中，使用蛋白酶例如胰蛋白酶，将蛋白经酶促消化成较小的肽。随后，所述肽被引入质谱仪并通过肽质量指纹图法或串联质谱(MS/MS)鉴定。这后一种方法被称为“自下而上的”蛋白组学，并利用肽水平的鉴定来推断蛋白的存在情况。自下而上的蛋白组学是一种鉴定蛋白和表征其氨基酸序列以及PTM的优选方法。

自下而上的蛋白组学的一种熟知方法是Edman降解。在这种方法中，氨基端残基被标记并从肽上切下，而不破坏其它氨基酸残基之间的肽键。因为Edman降解是从蛋白的N-端开始，所以，如果N-端氨基酸经过了化学修饰或如果它被隐藏在天然蛋白体内，则是不可靠的。为了可辨别的结果，还需要猜测或单独的程序来确定二硫桥的位置，以及需要1皮摩尔或更高的肽浓度。因此，Edman方法不适合对长度超过50个氨基酸的蛋白或具有PTM的蛋白测序。