[发明专利]分离和检测氧化固醇的方法

说明书

提供用于测定固醇样品的纯度的分析方法。这些方法包括提供HPLC洗脱剂，其包括固醇、与所述固醇相关的其它化合物和移动挥发相；从所述HPLC洗脱剂中产生液滴的气溶胶；干燥所述液滴以获得所述固醇的残余颗粒；使所述固醇的残余颗粒与离子流接触，所述离子流将尺寸依赖性电荷施加到所述残余颗粒的每一个以产生电信号，并且测量所述电信号以测定所述样品中所述固醇的纯度。所述固醇可以是OXY133或OXY133单水合物。

背景技术

通常采用不同的生物物质来促进医学应用中的骨骼生长，包括骨折愈合和骨骼疾病(包括脊柱疾病)的手术管理。脊柱融合通常由类似于整形外科医生和神经外科医生的外科医生进行，以解决退行性椎间盘疾病和影响腰椎和颈椎的关节炎。历史上，通常从患者的髂嵴取出的自体骨骼移植已被用于增强椎骨层之间的融合。

一种成骨性并且通常用于促进脊柱融合的蛋白质是重组人类骨形态生成蛋白-2(rhBMP-2)。美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration)(FDA)已经批准其用于单层前路腰椎椎体间融合。从那时起，rhBMP-2的使用已显著增加，并且其使用的适应症已经扩展到包括后路腰椎脊柱融合以及颈椎融合。

氧化固醇形成存在于循环中以及人类和动物组织中的一大类胆固醇氧化衍生物。已发现氧化固醇存在于动脉粥样硬化病变中，并且在各种生理过程，例如细胞分化、炎症、细胞凋亡和类固醇产生中起作用。一些天然存在的氧化固醇具有稳定的成骨特性并且可以用于生长骨骼。天然存在的最有效的成骨性氧化固醇，即20(S)-羟基胆固醇当应用于能够分化成为成骨细胞和脂肪细胞的多能间充质细胞中时，具有成骨性和抗脂肪生成性。

一种这类氧化固醇是Oxy133或(3S,5S,6S,8R,9S,10R,13S,14S,17S)17-((S)-2-羟基辛-2-基)-10,13-二甲基十六氢-lH-环戊并[a]菲-3,6-二酚，其呈现以下结构：

Oxy133是一种合成的小分子，其促进哺乳动物的骨骼生长。目前，使用气相色谱(GC)和衍生化分析氧化固醇类化合物。这是一个漫长的过程，需要加热样品，并不是监管机构的首选。与高效液相色谱(HPLC)配对的目前可用的工业检测技术不稳定，或在相关杂质和降解的存在下不够敏感以检测Oxy133。

Oxy133分子缺乏发色团，使色谱不足。另外，与母体化合物密切相关的已知杂质难以通过如蒸发光散射(ELS)、折射率(RI)和质谱(MS)的技术检测。

需要评估纯度以确保OXY133的安全性和功效，并且通常通过应用HPLC/UV方法来实现。与HPLC配对的标准工业检测技术不稳定，或在相关杂质和降解的存在下不够敏感以检测OXY133。

当OXY133呈单水合物形式时，由于存在需要分离、定量和鉴定的相关杂质，例如非对映异构体，通常难以分析Oxy133单水合物。已知杂质与母体化合物密切相关，并且难以通过蒸发光散射(ELS)、折射率(RI)和质谱(MS)等技术检测。

因此，需要克服这些检测技术的缺点并且在需要验证ICH质量控制准则的分析方法发展(AMD)阶段期间提供用于测定含有作为关键路径活性的一部分的OXY133产物的样品的含量和纯度的可靠分析方法。测定OXY133样品的纯度的方法会是有益的，所述样品不依赖于样品中发色团的存在。可以检测非挥发性分析物或残余物的方法也是有益的。

发明内容

在一些实施例中，提供用于测定OXY133样品的纯度的测定方法，所述方法包含提供包括OXY133、OXY133杂质和移动挥发相的HPLC洗脱剂；从HPLC洗脱剂中产生液滴的气溶胶；干燥液滴，得到OXY133的残余颗粒；使OXY133残余颗粒与离子流接触，所述离子流对每个残余颗粒施加尺寸依赖性电荷，以产生电信号，所述电信号的水平与OXY133的带电残余颗粒的量成比例；并且测量电信号以测定样品中的OXY133的纯度。在若干实施例中，OXY133包含OXY133单水合物。