[发明专利]氨基酸定量方法和氨基酸定量用试剂盒

说明书

本发明提供使用氨酰tRNA合成酶(AARS)选择性且简便、高灵敏度地定量测定对象的氨基酸(L型和/或D型氨基酸)的方法和氨基酸定量用试剂盒。上述氨基酸定量方法，其特征在于：在使用AARS定量样品中的氨基酸量(L型和/或D型氨基酸)的方法中，通过使AARS和氨基酸从一度形成的氨酰AMP‑AARS复合体中游离、并将它们再次用于氨酰AMP‑AARS复合体的形成，最终产生达到比样品中所含的氨基酸多的摩尔数的作为测定对象的焦磷酸等反应产物；以及用于实施该方法的氨基酸定量用试剂盒。

技术领域

本发明涉及氨基酸定量方法和氨基酸定量用试剂盒等。

背景技术

L-氨基酸(L-AA)作为生物体内蛋白质的构成成分担负着重要作用，其种类为20种。关于L-氨基酸的功能性进行了许多的研究，L-氨基酸在药品、加工食品、健康食品等各种产业中使用。例如，食品中的游离L-氨基酸与味道、加热后的香味、保存性、摄取后的生物体调节功能等有关，作为食品科学或营养科学领域中的重要要素而受到关注。另外，近年来发现了血液中的L-氨基酸浓度根据疾病而发生变化，通过测定血液中的氨基酸浓度，还将其充分用作可诊断肺癌、胃癌、大肠癌等癌症的生物标志物。

另外，氨基酸中存在着作为L-氨基酸的光学异构体的D-氨基酸(D-AA)，其种类为19种。D-氨基酸也存在于生物体内，其生理功能尚未明确。然而，近年来，由于分析技术的进步，分析D-氨基酸成为可能，例如可知：D-丝氨酸在阿尔茨海默病(Alzheimer disease)患者的脑脊髓中增多、D-天冬氨酸在肌肉老化的同时减少、而D-丙氨酸与螃蟹、虾的甜味有关等，D-氨基酸的生理功能受到关注。因此，L型或D型氨基酸定量技术在使用氨基酸的产品开发、品质管理、诊断等各个领域成为必不可少的技术。

作为L-氨基酸的氨基酸定量技术，已知有下述方法：通过液相色谱法分离氨基酸，利用茚三酮或荧光衍生物化剂邻苯二甲醛的显色反应进行检测。另外，作为D-氨基酸的氨基酸定量技术，已知有在D-氨基酸中加入荧光衍生物化剂邻苯二甲醛和手性衍生物化剂N-酰基-L-半胱氨酸进行非对映异构体荧光衍生化、再通过液相色谱法进行分析的非对映异构体法或二维液相色谱法(非专利文献1)。然而，该方法中1个样本的分析时间需要2小时左右，因此分析费时间，存在着不适合测定多个样本的问题。

作为其他的氨基酸定量技术，已知有利用与L-氨基酸或D-氨基酸发生作用的酶的氨基酸测定方法(专利文献1、非专利文献1)。然而，该方法存在以下问题：对作为目标底物的氨基酸的选择性低，还与目标以外的氨基酸反应，另外，不具备对应于20种(当为D-氨基酸时是19种)氨基酸的酶。

氨酰tRNA合成酶(AARS)是与生物体内的蛋白质合成有关的酶，按照以下的反应式1和2产生氨酰tRNA。针对20种L-氨基酸(L-AA)，存在特异性的20种AARS。因此，认为是对作为靶的氨基酸和tRNA的选择性非常高的酶。

[化学式1]

(反应式1)

L-AA + ATP + AARS 氨酰AMP-AARS复合体+ PPi

(反应式2)

氨酰AMP-AARS复合体+ tRNA 氨酰tRNA + AMP + AARS

该反应中，在产生焦磷酸(PPi)的同时，每1分子的腺苷三磷酸(ATP)、L-氨基酸(L-AA)与AARS作用，从而形成氨酰腺苷酸(氨酰AMP)-AARS复合体这种反应中间体。在该复合体中，由于氨酰AMP通常与AARS强力结合，因此认为只要不加入tRNA或者亲核试剂(亲核剂)(胺类)来分解复合体，上述的AARS反应就不会进行(专利文献2、非专利文献2～3)。另外，已知在该反应的反应式1中，当产生大量的焦磷酸时，作为反应式1的逆反应的氨酰AMP-AARS复合体被焦磷酸分解，发生了产生氨基酸、AARS和ATP的ATP-PPi交换反应(非专利文献4)。