[发明专利]非破坏性种子基因分型

说明书

提供在基本上不影响所分析的种子后续萌发情况下，从单粒种子可靠释放母方和/或父方DNA的方法和手段。该方法特别地适用于小粒谷物(包括小麦)的基因组分析。该方法可以包括改善DNA回收的酶促处理。

发明领域

本发明属于植物的分子基因组分析领域。提供在基本上不影响所分析的种子后续萌发情况下，从个体种子可靠释放母方和/或父方DNA的方法和工具。该方法特别地适用于小粒谷物(包括小麦)的基因组分析。这些方法可以用于多种情形下，包括用于育种工作中。

背景

种子工业中研究和开发活动日益利用基因组分析鉴定并追踪具有改善和/或所需特征的的植物。可以通过传统育种技术、诱变、转化等获得这类特征。传统上，这些过程期间对小植物或植物进行基因组分析，所述小植物或植物已经生长到充分发育的状态以允许在损伤植物的情况下对组织采样。在鉴定所需的植物后，允许这些植物进一步生长并结种，同时弃去不想要的小植物或植物。就使用温室或其他生长设施中的宝贵空间而言，这种过程相当无效率。

也可以从单粒种子(individual seeds)分离DNA，但是较早的分离程序导致破坏种子。因此，开发了涉及不损伤胚萌发并发育成植物的能力情况下，对种子部分采样的方法。对采样的部分或种子碎片进行DNA分析。使用例如自动化切割装置或激光束，分离种子碎片。WO2011/082316、WO2011/l 19763、WO20111/163326、WO2012/122156、WO 2014/071271中描述了这类方法。

美国专利8,959,833和7,703,238描述了一种分析种子群体中单粒种子的高通量非破坏性方法，所述方法包括使用自动采样器，从群体中的每一个或多个单粒种子取出组织样品，同时保留一粒或多粒已采样种子的的萌发活力，并且对一份或多份组织样品分析表示至少一个遗传或化学性状的一个或多个特征的存在或不存在。

名为“从植物组织分离DNA的酶促方法”的WO2004/056984描述了利用细胞壁降解酶的混合物从植物组织分离DNA的方法。本发明也涉及从植物组织分离DNA的试剂盒，其中试剂盒包含细胞壁降解酶的混合物。本说明书提出向种子应用这些方法。

Manen等人2005(BMC Plant biology 2005 5.23)描述了一种从植物组织提取DNA的充分自动化的酶促方法。

Zheng等人(BioTechniques 58:234-243,2015)公开了通过对修饰的96孔板中固定的未萌发种子的少量子叶组织采样，对棉花种子进行非破坏性高通量DNA提取和基因分型的方法。孔中固定种子包括施加水溶性胶。使用基于氢氧化物的DNA提取过程，以基于平板的样式处理采样的量。在基于PCR针对SNP(KASP测定法)和简单序列重复(SSR)的基因分型之前，稀释等分试样。

名为“从玉米种子非破坏性分离DNA”的WO2014/195199涉及从生物材料如种子分离DNA，同时保留活种子供进一步使用的系统和方法。从中分离出DNA的种子仍有活力并且基于浸种溶液的DNA分析而使用或弃去。浸种溶液可以基本上具有通过使用完整的种子预处理从浸种溶液消除的来自种子的全部混淆性母方DNA。认为这种方法特别可用于玉米种子。公开的方法共同具有以下步骤：暴露种子胚乳并在非破坏性DNA释放溶液中浸泡种子。在实例中，DNA释放溶液是碱性溶液，包含20mM NaOH。

尽管可获得以非破坏性方式进行种子基因分型的几种方法，仍需要备选和/或改进的更可靠和更稳健的从种子、尤其谷物种子如小麦种子分离DNA(包含父方DNA)的技术。

[10].如以下多种实施方案、实施例和权利要求中所述，本发明提供这类方法。

发明简述

在第一实施方案中，提供分离核酸的方法，所述方法包括从小粒谷物种子分离核酸(包括DNA)和/或提供分析小粒谷物种子群体的方法，所述方法包括步骤