[发明专利]用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系

权利要求书

1.一种用于产生细胞系的方法，其包括以下步骤：

a.提供多个哺乳动物B细胞，其中所述多个B细胞中的每一个包含编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列，其中所述转基因基因组DNA序列插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座，特别是IgH基因座中，并且其中所述转基因基因组DNA序列适合于被定点核酸酶、特别是CRISPR-相关核酸内切酶(Cas9)切割；

b.用编码目标蛋白的第二转基因DNA序列替换编码所述标志物蛋白的所述转基因基因组DNA序列；

c.基于所述标志物蛋白的存在或不存在来分选所述B细胞；和

d.收集其中不存在所述标志物蛋白的B细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种B细胞选自包含原代B细胞、永生化B细胞、杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、浆细胞瘤细胞和淋巴瘤细胞的组。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标志物蛋白和/或所述目标蛋白在内源性免疫球蛋白启动子、特别是V_H启动子的控制下表达。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述多个B细胞中的每一个中，内源性V_H基因和内源性V_L基因被破坏。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个B细胞经遗传修饰以组成型表达所述CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个B细胞经遗传修饰而以可诱导和可滴定的方式表达活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个B细胞包含安全港基因座，并且其中包含编码所述CRISPR相关核酸内切酶的DNA序列的第一表达盒插入到所述安全港基因座中。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个B细胞包含安全港基因座，并且其中包含编码所述活化诱导胞苷脱氨酶(AID)的DNA序列的第二表达盒插入到所述安全港基因座中。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过Cas9介导的位点定向DNA切割，和随后通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)进行的所述第二转基因DNA序列的整合，从而介导所述转基因基因组DNA序列的所述替换。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是全长抗体，特别是基于合成抗原结合片段(sFAb)构建体的全长抗体。

11.一种产生蛋白变体文库的方法，其包括根据前述权利要求中任一项的方法，随后进行以下额外步骤：用随机化核酸序列(通过供体dsDNA或ssDNA上的随机化区域)修饰所述转基因DNA的区域。

12.一种产生蛋白变体文库的方法，其包括根据前述权利要求6至11中任一项所述的方法，随后进行以下额外步骤：诱导所述活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的表达，从而通过诱导型合成体细胞超突变(iSSHM)在所述目标蛋白内产生多种基因组突变。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标志物蛋白是荧光蛋白。

14.通过前述权利要求中任一项所述的方法获得的人B细胞系，其包含经表达的转基因基因组DNA序列，所述转基因基因组DNA序列插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座中。