[发明专利]用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系

说明书

根据本发明的第一方面，提供了产生细胞系的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供多个哺乳动物B细胞，其中所述多个B细胞中的每一个包含编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列，所述标志物蛋白插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座中，并且其中所述转基因基因组DNA序列适合于被定点核酸酶、特别是Cas9切割；(b)用编码目标蛋白的第二转基因DNA序列替换编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列；(c)基于标志物蛋白的存在或不存在来分选B细胞；和(d)收集其中不存在标志物蛋白的B细胞。

本发明涉及工程化细胞系及其用于快速产生用于蛋白表达的稳定细胞和产生用于定向进化和蛋白工程的蛋白文库的用途。

背景技术

目前可用的用于从哺乳动物细胞产生蛋白的方法主要依赖于三种细胞系中的随机转基因整合：人胚胎肾293(HEK293)细胞、小鼠骨髓瘤细胞(Sp20和NS0)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。这些方法既昂贵又耗时。用于治疗性蛋白生产的生物技术工业标准要求产生稳定的重组蛋白生产细胞系，当从冷冻的细胞储备恢复时，其能够几乎无限地生产蛋白。

通过定向进化工程化蛋白需要通过体外诱变方法(例如，易错PCR、简并引物PCR诱变、DNA改组(DNA shuffling)，然后克隆到表达宿主中并高通量筛选。可在哺乳动物细胞中产生的文库的大小由于差的转染效率而受到限制。因此，蛋白文库的高通量筛选通常采用正交表面展示平台，主要基于体外或微生物表达(例如，核糖体、噬菌体、酵母及细菌展示)。与哺乳动物细胞相比，这些宿主可能对蛋白折叠、糖基化模式和表达具有大的影响。然而，关键的是，标准系统不能有效地表达和筛选一些复杂的蛋白(例如，全长抗体)。另外，在治疗性蛋白的情况下，在体外或微生物系统中的文库筛选之后，经常需要将基因亚克隆到哺乳动物表达系统中以进行适当的表征。

本发明的基础问题是提供用于产生稳定哺乳动物细胞系的快速、可靠和廉价的方法，其可用于重组蛋白表达以及用于产生和筛选用于蛋白工程和定向进化应用的大蛋白文库。该问题通过独立权利要求的主题来解决。

定义

在本说明书的上下文中，术语“序列同一性”和“序列同一性百分比”是指通过比较两个对齐的序列而确定的值。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的比对可如下进行：通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的全局对齐算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性检索方法，或通过这些算法的计算机化实施方式，包括但不限于：CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。用于执行BLAST分析的软件可公开获取，例如通过美国国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

用于比较氨基酸序列的一个实例是BLASTP算法，其使用默认设置：预期阈值：10；字数：3；查询范围内的最大匹配：0；矩阵：BLOSUM62；空位成本：存在11，延伸1；合成调整：条件合成得分矩阵调整。用于比较核酸序列的一个这样的实例是BLASTN算法，其使用默认设置的：预期阈值：10；字数：28；查询范围内的最大匹配：0；匹配/错配得分：1.-2；空位成本：线性。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指分别使用用于蛋白和核酸比较的上述确定的默认参数，使用BLAST程序套件(Altschul等，J.Mol.Bio.215:403-410(1990))获得的值。

在本说明书的上下文中，术语B细胞是指已经通过V(D)J重组完成免疫球蛋白重链和轻链基因座的基因组重排的淋巴系细胞。

在本说明书的上下文中，术语IgH基因座指免疫球蛋白重链基因的基因座。