[发明专利]基于柱的完全可扩展的rAAV制造工艺

权利要求书

1.一种纯化重组腺相关(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)收获含有rAAV载体颗粒的细胞和细胞培养上清液以产生收获物；

(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；

(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；

(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物；

(e)过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；

(f)将步骤(e)中产生的所述澄清的裂解物或稀释的澄清的裂解物进行阴离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，并任选浓缩所述柱洗脱液以产生浓缩的柱洗脱液；

(g)对步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液进行尺寸排阻柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白质杂质分离，并任选地稀释所述第二柱洗脱液，以产生稀释的第二柱洗脱液；

(h)将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述稀释的第二柱洗脱液进行阳离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白质或其它生产杂质分离，并任选地浓缩所述第三柱洗脱液以产生浓缩的第三柱洗脱液；以及

(i)过滤步骤(h)中产生的所述第三柱洗脱液或所述浓缩的第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)和/或步骤(f)和/或步骤(h)的所述浓缩是经由或通过超滤/渗滤进行的，任选地通过切向流过滤进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的所述浓缩将所述收获的细胞和细胞培养上清液的体积减少约50％-90％。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)的所述浓缩将所述柱洗脱液的体积减少约80％-95％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物的所述裂解是通过微流化进行的。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括用核酸酶处理，从而减少污染核酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其中核酸酶包括全能核酸酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)中的所述过滤所述澄清的裂解物或所述稀释的澄清的裂解物是通过孔径为介于约0.1微米和0.8微米之间且包括端值的过滤器进行的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)中的所述稀释所述澄清的裂解物或所述稀释的澄清的裂解物是用缓冲乙酸盐水溶液进行的。

10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)中的所述第二柱洗脱液的所述稀释是用缓冲乙酸盐水溶液进行的。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述缓冲乙酸盐水溶液的pH为介于约4.0和7.0之间，包括端值。

12.根据权利要求1所述的方法，其中将从步骤(i)和/或步骤(i)得到的所述rAAV载体颗粒与表面活性剂一起配制以产生AAV载体制剂。

13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)中的所述阴离子交换柱色谱法包括聚乙二醇(PEG)调制的柱色谱法。

14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(f)中的所述阴离子交换柱色谱法包括在从所述柱中洗脱所述rAAV载体颗粒之前用PEG溶液洗涤所述柱。