[发明专利]基于柱的完全可扩展的rAAV制造工艺

说明书

根据本发明，其中提供了纯化重组腺相关(rAAV)载体颗粒的方法。

相关申请

本申请要求于2016年3月31日提交的美国临时专利申请No.62/316,252的优先权。前述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图在内的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

基因递送是用于治疗获得性和遗传性疾病的有前途的方法。已经描述了许多用于基因转移目的的基于病毒的系统，包括基于腺相关病毒(AAV)的系统。

AAV是依赖于辅助的DNA细小病毒，其属于依赖性病毒(Dependovirus)属。AAV需要辅助病毒功能，例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘，以便发生增殖性感染。在没有辅助病毒功能的情况下，AAV通过将其基因组插入宿主细胞染色体来建立潜伏状态。随后由辅助病毒感染拯救了整合的病毒基因组，其然后可以复制以产生感染性AAV后代。

AAV具有广泛的宿主范围，并且能够在合适的辅助病毒存在下在来自任何物种的细胞中复制。例如，人AAV将在共同感染犬腺病毒的犬细胞中复制。AAV未与任何人或动物疾病相关，并且在整合时似乎不会对宿主细胞的生物学特性产生不利影响。

可以通过全部或部分地删除AAV基因组的内部部分并在ITR之间插入感兴趣的核酸序列来改造AAV载体以携带感兴趣的异源核酸序列(例如，编码治疗性蛋白质的选定基因，抑制性核酸，例如反义分子，核酶，miRNA等)。ITR在这样的载体中保持功能，允许复制和包装含有感兴趣的异源核酸序列的rAAV。异源核酸序列通常还与能够驱动患者靶细胞中核酸表达的启动子序列连接。终止信号，例如多腺苷酸化位点，也可以包括在载体中。

感染性重组AAV(rAAV)载体的构建已在许多出版物中描述。参见，例如，美国专利No.5,173,414和5,139,941；国际公开号WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski et al.(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996；Vincent et al.(1990)Vaccines 90(Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Carter,B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；以及Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801。

重组腺相关病毒(AAV)载体在多个组的几个早期临床试验中显示出极好的治疗前景。开发这种新型生物制品以获得批准将涉及改进载体表征和质量控制方法，包括更好地理解载体设计和制造工艺参数如何影响临床等级载体中的杂质谱。

设计rAAV生产和纯化系统的一个重要目标是实施最小化/控制生产相关性杂质的生成的策略，生产相关性杂质例如蛋白质、核酸和载体相关杂质，包括野生型/假野生型AAV类(wtAAV)和AAV包裹的残留DNA杂质。由于产生rAAV载体的方式，去除AAV载体中的杂质是复杂的。在一个生产过程中，通过使用三种质粒的瞬时转染过程产生rAAV载体。将大量质粒DNA导入细胞中以产生rAAV载体。此外，当rAAV载体从生产细胞中释放时，细胞蛋白和核酸被共同释放。考虑到rAAV载体仅占生物质量的约1％，将rAAV载体纯化至可用作临床人基因治疗产品的纯度水平是非常具有挑战性的。(Smith PH Wright JF.Qu G.et al 2003,Mo.Therapy,7:8348；Chadeuf G.et al,Mo.Therapy 2005,12:744.Report from the CHMPgene therapy expert group meeting.European Medicines Agency EMEA/CHMP 2005,183989/2004)。