[发明专利]细胞裂解和核酸扩增的方法

说明书

本公开提供了一种核酸扩增方法。所述方法包括通过使样本与配方不包含磷酸盐缓冲剂组分的营养培养基接触来形成富集培养物；在促进靶微生物生长的温度下保持所述富集培养物一段时间；在保持所述富集培养物之后，通过将第一体积的所述富集培养物与第二体积的裂解缓冲剂混合来形成含水组合物；使所述含水组合物与有效量的水不溶性材料接触，所述水不溶性材料多价螯合干扰聚合酶介导的核酸扩增反应的物质；使所述含水组合物经受热裂解过程；以及，在使所述含水组合物经受热裂解过程之后，使所述含水组合物的一部分经受核酸扩增过程。还公开了用于裂解缓冲剂的组合物。

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2016年4月8日的美国临时专利申请62/319,876的优先权，该临时专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。

本申请已与其序列表(文件名为Sequence_Listing_77512WO003.TXT，2017年3月9日创建)相关联。此序列表文件包含722字节并且其全文以引用方式并入本文。

背景技术

用于检测病原体和其它微生物的常规方法是基于培养的方法，但是这些方法是耗时的、费力的，并且不再符合质量控制和诊断实验室提供快速的结果的需求。

克服检测病原微生物的困难(例如，培养微生物所涉及的长时间延迟)的努力已经引起了诸如基于DNA的诊断方法或核酸增殖方法的基因测试的开发。使用基于DNA的方法来源于每种病原体物种携带将其与其它生物体区分开的独特的DNA或RNA标记的前提。这些技术是最有前途的，并且越来越多地用于微菌的快速、敏感和特异性检测。

生物技术的进步已经引起各种各样的用于有效的核酸扩增的测定的开发。

含有微生物/病原体的样本的有效基因检测需要快速敏感的测定方法，其给出即时或实时的结果。分析和抑制由样本中的抑制物质引起的核酸扩增的时间和敏感性与基因测试的有用性有某些限制。

希望具有有效地且快速地减少或消除预期靶的核酸扩增的抑制的组合物和方法。

发明内容

本公开提供了一种改进的核酸扩增方法，其消除了由于样本中抑制性物质而对核酸扩增反应的抑制。有利的是，改进的方法避免了在核酸扩增反应中使用样本之前稀释该样本的需要，从而允许核酸扩增过程的敏感性增加。

在一个方面，本公开提供了一种核酸扩增方法。所述方法可包括通过使样本与实质上不含水溶性磷酸根离子的营养培养基接触来形成富集培养物，其中所述营养培养基包含第一缓冲剂；在促进靶微生物生长的温度下保持所述富集培养物一段时间；在保持所述富集培养物之后，通过将第一体积的所述富集培养物与第二体积的裂解缓冲剂混合以形成第三体积的含水组合物来形成所述含水组合物，其中将所述第一体积的所述富集培养物与所述第二体积的所述裂解缓冲剂混合包括将未稀释的第一体积的所述富集培养物与所述第二体积的所述裂解缓冲剂混合；使所述含水组合物与有效量的水不溶性材料接触，所述水不溶性材料多价螯合干扰聚合酶介导的核酸扩增反应的物质；使所述含水组合物经受热裂解过程；以及在使所述含水组合物经受热裂解过程之后，使所述含水组合物的一部分经受核酸扩增过程。所述裂解缓冲剂实质上不含水溶性磷酸根离子并且包含第二缓冲剂。所述裂解缓冲剂可包含有机多价阳离子螯合试剂，其中所述有机多价阳离子螯合试剂具有相对于三价铁的大于或等于10^4.2的第一亲和常数以及相对于镁的小于10^3.8的第二亲和常数，其中所述第一亲和常数和所述第二亲和常数是在pH 8.45下的20℃去离子水中测定的。裂解缓冲剂在25℃下可具有大于8.6的pH。所述含水组合物在25℃下可具有约8.45至8.85的pH。所述含水组合物中的第一缓冲剂和第二缓冲剂的组合浓度可为至少约15mM。所述第一体积与所述第二体积的比率可大于或等于3:1，并且所述第二体积与所述第三体积的比率小于或等于1:4。