[发明专利]用于测定体液样品中的靶分析物的浓度的方法

说明书

本发明公开了用于测定体液样品中的靶分析物的浓度的方法和设备。所述方法包括提供包括靶分析物的体液样品，提供内部标准溶液，其包括包含靶分析物的多种同位素的组分的混合物，其中每种同位素的浓度是未知的，将所述内部标准溶液添加至样品中，借助质谱仪分析包括内部标准溶液的样品，基于信号强度产生样品函数曲线，其中信号强度定义任意单位，借助样品函数曲线将分析物信号转化为相应的任意分析物单位，和借助代表取决于任意单位的浓度曲线的标准化函数将任意分析物单位转化为靶分析物的浓度。

发明领域

本公开的方法涉及用于测定体液样品中的靶分析物的浓度的方法。

相关领域

在许多生物医学和健康护理应用中，快速确定体液(诸如血液、血浆、血清、尿液、脑脊髓液(CSF)或组织提取物)中的分析物浓度是至关重要的。传统上，此类测量已经由基于免疫测定的技术诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)完成。此类技术依赖于抗体与样品内的靶分析物的选择性结合。在大多数测定中，与基于比色、荧光测定或放射性的检测系统连接的第二抗体用于检测分析物-抗体复合物。

已经开发了许多能够在生物流体上运行免疫测定的全自动装置，并且通常用于医院和研究设置中。尽管这些系统具有自动化和容量的优点，但它们也具有显著的缺点。例如，每种测定的特异性和选择性仅与所使用的抗体一样好。

最近，在临床和研究设置中传统上通过免疫吸附测定法分析的许多定量测定法正在通过基于质谱的技术进行分析。

基于与质谱偶联的液相或气相色谱(LC-MS或GC-MS)的方法经常被认为是绝对分析物定量测量的金标准，因为其具有固有的特异性、非常好的精确度和高灵敏度。然而，绝对定量的质量严重依赖用于将测量的信号转换成分析物浓度的校准过程的质量。LC-MS定量的现有技术方法依赖于稳定同位素稀释的概念和从参考标准产生的外部校准曲线。

稳定同位素稀释是这样的过程，其中在样品制备过程中尽可能快地将同位素标记的分析物结构(几乎全部是氘化的，¹³C标记的，¹⁵N标记的)添加至样品中。因此，样品用同位素标记物稀释。在样品制备期间和测量过程期间，假定或验证同位素标记物具有与样品中的靶分析物相同的特性。因此，该过程中的任何随机或系统误差将等同地影响靶分析物和同位素标记的分析物，使得它们的浓度比将保持相同。同位素标记的分析物的一个额外特征是其具有不同的质量(或更精确地质荷比)，其允许其与靶分析物分开检测。因此，该过程产生两种独立的信号，一种来自靶分析物(S_A)，而另一种来自同位素标记的分析物(S_istd)。然后，通过同位素标记的信号对分析物信号进行归一化，以产生信号比，其通常是峰面积比，以调整可能扰乱过程的任何系统或随机误差。这种归一化过程改善了整体精度。

外部校准过程依赖于含有已知浓度的靶分析物的外部校准物，其允许质谱检测器响应以校准曲线的形式描述。就像所有待测试的样品一样，校准物也用相同量的同位素标记的分析物掺入。这允许绘制信号比响应相对分析物浓度的图线，即校准曲线。

测量掺入同位素标记的分析物的未知样品以测定信号比(分析物信号/同位素标记分析物的信号)。然后使用外部生成的校准曲线将该归一化的信号响应转换为浓度。

依赖于同位素稀释的原理的外部校准曲线仅在以下情况下有效：1)同位素标记的分析物的量在校准物和待定量的所有未知样品中完全相同，2)在校准物的基质和待测量的未知样品的基质之间的仪器响应没有差异和3)在外部校准的时间点的MS响应与在该时间点的MS响应相同。因此，显然，外部校准曲线具有适合于定量未知样品的确定寿命。该寿命取决于如何好地控制上述三个方面。目前通过增加校准频率使风险最小化，以致于在许多实验室开发的LC-MS测试中，每天几次生成新的校准曲线。一些方法需要每20个未知样品的频率进行新的全7点外部校准，以确保外部校准曲线适合于定量。