[发明专利]DNA序列的靶标特异性RNA转录方法在审
申请号: | 201780023444.9 | 申请日: | 2017-02-10 |
公开(公告)号: | CN109072287A | 公开(公告)日: | 2018-12-21 |
发明(设计)人: | 基斯·布朗 | 申请(专利权)人: | 嘉普科德基因组学公司 |
主分类号: | C12Q1/6844 | 分类号: | C12Q1/6844;C12N15/10 |
代理公司: | 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262 | 代理人: | 贺淑东 |
地址: | 美国加利*** | 国省代码: | 美国;US |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 靶标 测序 扩增 合成 特异性扩增 特异性RNA 转录 相邻序列 重复元件 试剂盒 克隆 | ||
本文公开了使用直接从靶标合成的RNA中间体进行长距离靶标特异性扩增和测序以消除早期合成错误的克隆扩增的方法。方法允许鉴定靶标相邻序列,如与重复元件靶标相邻的序列。本文还公开了用于扩增和测序的组合物和试剂盒。
本申请要求于2016年2月12日提交的美国临时申请序列号62/294,875的权益,该临时申请的内容通过引用以其全文并入于此。
背景技术
本文的公开内容涉及分子生物学领域,如核酸样品中与重复序列相邻的核酸序列的扩增和鉴定。
PCR或PCR技术的变型以及杂交捕获是靶向测序的主要方法。虽然广泛使用,但二者均对长读取测序仪具有限制。杂交捕获使用带有生物素的短RNA或DNA探针与靶DNA杂交并“拉下”感兴趣的序列。对于长靶序列,这种方法是低效的,这既是因为需要许多寡核苷酸探针,又是因为该过程往往导致在拉下过程中长DNA分子的物理剪切。这些缺陷限制了使用单分子技术的连续测序仪读取的长度。
长距离PCR已被用作备选方案,但也提出了挑战。长距离PCR难以多路化(multiplex)。通常,由于在目标区域之外的相反链上需要相反的PCR引物,因而失去了检测大染色体事件如易位的能力。另外,PCR的克隆扩增限制了检测非均相样品如肿瘤中的低频率体细胞变异的灵敏度,并且可能从反应的早期循环开始传播聚合酶错误,如点突变或易位。此外,长距离PCR有时展现出模板转换,从而在扩增产物中产生错误。
发明内容
基因组测序技术的进步极大地增加了我们对人类遗传变异及其对疾病的贡献的理解。短读取DNA测序技术(Illumina,Thermo Fisher,Qiagen)产生了数十亿个短读取,导致单核苷酸多态性以及小插入和缺失的常规鉴定。这些短读取测序技术未显示出检测更复杂变异的灵敏度,如大规模染色体重排、易位和可动元件重排。长读取测序技术(PacificBiosciences,Oxford Nanopore)已显示出生成超过10,000个碱基对的单分子读取长度的能力,但没有测序和组装完整的人类基因组的能力。本文公开的靶向策略利用了这些更长的读取长度。
在这里,我们描述了长距离靶标特异性扩增的方法,其中仅对原始模板进行扩增,以便相对于样品DNA序列产生原始靶序列的增加的拷贝。扩增的产物直接来源于样品模板,而不是来源于合成的扩增中间体或先前合成的样品模板的拷贝。因此,合成的拷贝不包含来自先前合成反应的错误。这显著降低了早期错误在反应过程中差异放大的可能性。因为合成产物不用作模板,所以合成中的任何错误均独立地导出,并且不可能从一个分子匹配至下一个分子。因此,通过比较所合成的产物,人们可以容易地识别合成中的错误,并且更容易地导出样品序列。
所公开的主题在伴随本公开内容的权利要求列表中部分地进行了总结。
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