[发明专利]肽-HLA复合物及产生其的方法

说明书

本文提供哺乳动物衍生的HLA I类分子用于体外肽交换的用途。例如，提供了产生与预选肽复合的HLA I类分子的方法，包括：(a)提供与现有肽复合的哺乳动物衍生的HLA I类分子；(b)用预选肽体外孵育与现有肽复合的HLA I类分子，其中预选肽的浓度足以取代现有肽以产生与预选肽复合的HLA I类分子；并且HLA I类分子包含a1、a2、a3和β2m结构域。

技术领域

本发明涉及人白细胞抗原(HLA)I类分子的领域，更具体地，涉及产生与肽复合的HLA I类分子的方法。

背景技术

使用具有肽-MHC(pMHC)多聚体的流式细胞术的抗原特异性T细胞分析已建立为免疫学中的标准技术^1,2。这些试剂能够在与感染、自身免疫、GVHD和癌症关联的免疫反应过程中进行抗原特异性T细胞的寻迹和表型分析。

T细胞中的αβT细胞抗原受体(TCR)识别细胞表面上由MHC I类或II类分子呈递的肽抗原^3,4。TCR和pMHC之间的相互作用非常弱，以至于单体可溶性pMHC通常不能与携带同源TCR的T细胞的细胞表面稳定结合。基于抗生物素蛋白-生物素的pMHC四聚体形式的pMHC多聚体首先由Mark Davis的小组于1996年引入，并立即改变抗原特异性T细胞的分析⁵。pMHC多聚体已用于许多研究中，并且若干商业供应商，例如BD BioSciences^TM、ProImmune^TM、Immudex^TM和TC matrix^TM，以各种形式销售pMHC多聚体。pMHC多聚体可以与对其他细胞表面分子特异的抗体组合使用⁶。因此，TCR和免疫佐剂分子的同时染色允许将抗原特异性T细胞分类成各种表型不同的亚组。这种表型分析可用于表征抗原特异性T细胞的抗原暴露、效应功能和状态。

大肠杆菌表达是产生MHC I类蛋白质的优选方法，并且可以提供大量高度纯化的蛋白质(http://tetramer.yerkes.emory.edu/support/protocols)。与II类分子不同，大多数I类分子在沟(groove)中没有肽而不稳定⁷。因此，在几乎所有情况下，MHC I类分子都装载有目的合成肽，其中I类表达过程与肽加载过程偶联以产生完整的pMHC复合物。细菌系统存在一些已知问题。对于一些HLA I类基因，例如HLA-B等位基因，使用细菌的pHLA生产很困难，部分原因是重折叠不良^8,9。尽管I类蛋白质上的糖基化对于pMHC和同源TCR之间的相互作用不是必需的，但细菌表达的MHC I类蛋白质上缺少糖部分可能对它们的稳定性具有负面影响。此外，细菌表达和体外重折叠的pMHC蛋白可能不具有与哺乳动物中产生的和体内重折叠的完全相同的高级结构。虽然生成的完整pMHC蛋白的体外肽交换是可能的，但它需要多个复杂的步骤^10-12。因此，pMHC蛋白的高通量生产是劳动密集型的、麻烦的并且不能广泛获得。最后，已显示pMHC多聚体结合所需的pMHC-TCR亲和力超过T细胞活化所需的亲和力¹³。观察到的亲和力阈值的差异意味着当前的pMHC四聚体染色不能检测所有抗原特异性T细胞，尤其是具有低亲和力的那些。当pMHC多聚体用于染色与自身免疫和癌症中的免疫应答相关的自身抗原特异性T时，未能染色所有表达具有广泛亲和力的TCR的同源T细胞可能是严重的问题，其倾向于表达较低亲和力的TCR。

发明内容

根据一个方面，提供一种产生与预选肽复合的HLA I类分子的方法，其通过提供首先与现有肽复合的哺乳动物衍生的HLA I类分子。然后将与现有肽复合的HLA I类分子与预选肽以足以替代现有肽的浓度在体外孵育，从而产生与预选肽复合的HLA I类分子。HLA I类分子包含α1、α2、α3和β2m结构域。

根据进一步的方面，提供一种用于生产与预选肽复合的HLA I类分子的试剂盒，包含与现有肽复合的哺乳动物衍生的HLA I类分子和对应于上述方法的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包含预选肽。