[发明专利]CRISPR和其他基因疗法安全递送到人类和动物中的大部分体细胞

说明书

一种方法，使得将核酸序列递送至人体中的大部分，甚至99.9％和更多的细胞而不必几乎杀死受体成为可能。可应用其来安全地提供任何基因疗法。本发明包括一组已知的化合物，其中的许多已获批准，它们以新颖的方式组合以防止对引入到体内的递送载体(衣壳或合成的载体)的水平产生免疫系统反应，该水平可高于经证实会导致人类死亡的水平5个或更多个数量级。

发明人：Brain·P·Hanley

申请人：Brain·P·Hanley

相关应用

本申请是基于并要求2016年5月12日提交的美国专利申请62/335,561的优先权的PCT申请，其全部内容通过引用并入本文，如同完整阐述一样。

公开内容的背景

公开内容的技术领域

本发明属于基因疗法及其促成科技的领域。

相关技术的描述

本发明需要理解脓毒症的机制和Toll样受体(TLR)的刺激。本发明还需要对CRISPR、什么是基因疗法和什么是CHYSEL系统接头有基本理解。

免疫系统对高剂量刺激脓毒症样综合征的易感性

通常认为脓毒症的原因是感染。然而，从技术上讲，脓毒症是由于免疫系统对其敏感的病原体相关分子模式(PAMP)所造成。这些触发Toll样受体(TLR)c型凝集素受体(CLR)和响应于核酸基序的细胞质模式识别受体(cPRR)。此外，来自细胞碎片的损伤相关分子模式(DAMP)也会触发炎性细胞因子。

脓毒症的根本原因可能是来自细菌、真菌或病毒的PAMP，但它通常由细菌细胞壁破碎引起，技术上称为内毒素或脂多糖(LPS)。因此，脓毒症的标准实验室模型是注射无菌LPS。这也可以复制多器官衰竭，这通常由DAMP过度刺激引发。在本发明的情况下，触发剂是病毒体衣壳，最常见的是腺相关病毒(AAV)菌株或慢病毒(LV)菌株。另外，存在核酸的细胞溶质受体，并且TLR之间存在相互作用。

在小鼠模型中，LPS的LD₅₀取决于肝脏蛋白合成。25克小鼠中正常LPS LD₅₀约为150微克(6毫克/千克)，需要35小时才能完成其过程。然而，在用β-半乳糖胺预处理以抑制肝脏蛋白合成的小鼠中，小鼠LD₅₀约为5纳克(200ng/kg)，少30,000倍。相比较地，正常人显示每公斤2-4纳克LPS时的反应。对于LPS的人LD₅₀低于5微克/千克，比小鼠低三个数量级。人类重6000倍，但在仅为杀死25克小鼠的剂量的两倍剂量下死亡。如果人类具有小鼠的免疫系统，对于普通成年人而言，LPS LD₅₀应该是900毫克左右而不是300微克。据认为人LPS敏感性是由于唾液酸结合Ig样凝集素(siglecs)中的突变造成。表型上，敲除siglecs产生高反应性免疫系统组分。缺失的siglec-13和在其他灵长类动物中有活性的失活的siglec-17影响对TLR4的控制。TLR4是LPS的受体。它也是DAMP信号通路中HMGB1的靶标。

在查看任何动物模型(包括所有非人类灵长类动物)的研究结果时，应始终记得已将控制TLR4过度刺激的人体免疫系统敲除的事实。动物可以容易地容忍杀死人类的免疫系统攻击。腺病毒相关病毒(AAV)引发与内毒素不同的TLR。存在用于基因治疗递送的不同AAV株。在肝脏中，库普弗细胞通过TLR2对AAV2敏感，但其他细胞通过TLR9对AAV2敏感。通过阻断受体，这些反应可以减弱但不能消除。

“TLR2识别来自革兰氏阳性细菌的肽聚糖，来自酵母细胞壁的酵母聚糖和来自克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的糖磷脂酰肌醇锚。当与TLR1二聚化时，TLR2还可以识别细菌脂蛋白，当与TLR6二聚化时，TLR2可识别支原体脂蛋白。...TLR9由存在于细菌DNA和病毒诸如小鼠巨细胞病毒和单纯疱疹病毒中的未甲基化的CpG DNA基序所激活。”