[发明专利]幼年期藤壶的冷冻保存

权利要求书

1.用于大规模冷冻保存藤壶的卵、无节幼体和/或幼年藤壶的方法，所述方法包括按以下顺序进行的步骤：

-从该生物体排水，

-添加5-10M包含选自由以下组成的组的冷冻保护剂的冷冻保护剂溶液：乙二醇、丙二醇、甘油、和二甲亚砜、或其混合物，

-根据以下后续步骤在容器中冷却混合物：

(i)在不超过-1℃min^-1的第一缓慢冷冻速率下冷冻，直到接近其中所述混合物中的所述生物体开始结晶的温度；

(ii)在不超过-0.1℃min^-1的第二缓慢冷冻速率下冷冻，直到所述混合物中的所述生物体和所述冷冻保护剂完全结晶；

以及

(iii)第一快速冷冻速率至超低温储存温度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述冷冻保护剂溶液与所述经排水生物体之间的体积比是至少1:4、优选地为1:4至2:1、更优选地为1:4至1:1。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一缓慢冷冻速率是-0.5℃min^-1或更小、优选-0.3℃min^-1或更小、更优选-0.1℃min^-1或更小。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述第一冷冻步骤之前进行平衡步骤，优选持续5至60分钟、更优选15至30分钟、最优选约15分钟。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述平衡步骤与-0.5℃至-1℃的第一缓慢冷冻速率组合。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二缓慢冷冻速率为-0.015℃min^-1至-0.1℃min^-1、优选为-0.04℃min^-1至0.08℃min^-1、更优选为-0.05℃min^-1、最优选为-0.04℃min^-1。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二缓慢冷冻速率持续直到接近至少-30℃、优选接近至少-35℃、更优选接近至少-36℃、最优选-38℃至-46℃。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经排水生物体在排水之后具有6％至14％的干重含量、更优选具有8％至12％且最优选约10％的干重含量。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂溶液包含2.0％至4.5％NaCl、更优选3.0％至3.8％NaCl、最优选3.2％至3.8％NaCl。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中有待添加到所述生物体中的所述冷冻保护剂的浓度为6M-8M、更优选6.5M-7.5M。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述冷冻保护剂的浓度为至少6M、更优选至少7M、最优选7.2M。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂是乙二醇与丙二醇的混合物，优选各自约50％的混合物、更优选约75％乙二醇与25％丙二醇的混合物。

13.根据权利要求4所述的方法，其中所述平衡步骤在0℃至10℃、更优选3℃至8℃、最优选约5℃的温度进行。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个单元中有待冷冻保存的材料的量是至少5g至10g、优选至少10g至50g、更优选至少50-100g、最优选200g-2000g。