[发明专利]分离有核细胞和有核细胞群的方法及其应用

说明书

本公开内容提供了将目标有核细胞(例如胎儿间充质干细胞)与无核红细胞分离的方法，通过本公开内容方法可获得的细胞群，以及使用分离的目标有核细胞及其子代来检测胎儿异常和进行干细胞治疗的方法。

1.相关申请的交叉引用

本申请要求2016年4月7日提交的美国临时申请62/319,523号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

2.背景技术

回收在外周血中循环的有核细胞(NC)(例如，在母体血液中循环的胎儿细胞，在临床缓解的患者的血液中循环的癌细胞，干细胞，内皮细胞和/或其他非常罕见的细胞)的主要障碍是单次血液收集物中这些细胞的总数非常低。

获得NC的第一个挑战是外周血和非外周血中无核红细胞(RBC)的数量超过非常需要的NC。例如，每1ml母体血液中的胎儿细胞数为2-6，这是1000000-3000000个有核母体细胞中有1个胎儿细胞，和1000000000-2000000000个红细胞中有1个胎儿细胞的比例。Krabchi等，2001，Clin.Genet.60:145-150。在诸如脐带血(UCB)等非外周血中，NC与RBC的比率为约1000比1。

已经设计了许多方法旨在获得稀有的NC母体血液。然而，在血液中存在的大量细胞中发现稀有的NC具有挑战性，特别是以保持其功能的方式。

大多数NC富集方法的第一步需要从含有NC的血液样品中去除RBC。通常，为了减少封闭或开放系统中RBC的数量和血浆体积，进行涉及添加或不添加外源介质的手动或半自动离心的方法，所述介质例如蔗聚糖(ficoll)、胶体二氧化硅颗粒(percoll)、羟乙基淀粉(HES)、葡聚糖、聚明胶肽(poligeline)和明胶。然而，这些方法在最终产物体积、残余RBC、细胞活力以及NC回收、单个核细胞(MNC)、CD34+细胞、集落形成单位细胞(CFU)和长期培养起始细胞(LTC-IC)方面差别很大，更不用说方法的复杂性和所需的处理时间。参见Tsang等，2001，Transfusion 41：344-352；Pilar Solves等，2005，Transfusion 45：867-873。

用于将无核细胞与有核细胞分离的经典且最简单的方法是通过密度梯度离心。密度梯度离心基于细胞密度分离细胞。可以使用密度梯度材料(例如Ficoll、Ficoll-Hypaque、Histopaque、Nycodenz和Polymorphprep)对血液样品进行密度梯度离心，所述密度梯度材料都是含有红细胞凝集剂的溶液。离心后，外周血样品形成上清液层，其含有血浆和血小板；在血液样品和分离介质之间的界面处的有核细胞层；和离心管底部的凝结沉淀物，其含有无核红细胞和一些有核细胞。有核细胞层可以与其他层分离，以产生从其中已经大量除去了无核细胞的有核细胞富集样品。然而，与其他方法一样，在密度梯度离心中NC通常以不可接受的高比率丧失。

除去RBC后，目前使用的NC富集方法包括不连续密度梯度离心、荧光激活细胞分选(FAGS)、磁激活细胞分选(MACS)、电荷流分离、显微操作、亲和素-生物素柱磁性含铁流体。这些不同方法的比较分析已经成为几篇综述的主题(Ho等，2003,Ann.Acad.MedSingap.32:560-597；McEwan,2005,Maternal Medicine Review 16:151-177；Kavanagh等，2010,Journal of Chromatography B,878:1905-1911)。虽然已经从母体血液中分离出各种胎儿细胞类型，如滋养细胞、白细胞、有核红细胞、血小板和造血祖细胞，但母体血液中存在的大多数类型胎儿细胞或胎儿细胞组合的可靠和可再现的分离似乎是难以实现的目标。

因此，本领域需要一种简单且可靠的，优选高产率的方法，以用于从血液样品中去除RBC，同时保留基本上所有的NC，并随后以可再现的方式将目标NC富集至高纯度。还需要从一个样品共分离/共富集至少两种不同类型的NC，例如胎儿细胞类型，例如胎儿有核红细胞和胎儿间充质干细胞。在某些情况下，本领域还需要一种确保NC功能损失最小的方法。

3.发明内容