[发明专利]新型AAV8突变衣壳和含有其的组合物

说明书

本文提供AAV8突变衣壳和包含所述AAV8突变衣壳的rAAV。在一个实施方案中，采用所述AAV8突变衣壳的载体显示相较于AAV8，在所选组织中的转导增加。

以电子形式提交的材料的引用并入

申请人据此以引用的方式将以电子形式随本文一起提交的序列表材料并入。这个文件标记为“UPN-16-7726PCT_ST25.txt”。

发明背景

腺相关病毒(AAV)在人基因疗法中具有极大前景，并且由于它能够提供长期基因表达以及缺乏病原性而已被广泛用于在各种研究中靶向肝、肌肉、心脏、脑、眼、肾和其它组织。AAV属于细小病毒科，并且各自含有由两个反向末端重复序列侧接的单链DNA。已报道几十种天然存在的AAV衣壳，它们的独特衣壳结构使得它们能够识别和转导不同细胞类型和器官。

自从始于1981年的首个试验以来，在基于腺相关病毒(AAV)载体的基因疗法的临床试验中，尚未报道任何载体相关毒性。AAV载体在临床试验中不断积累的安全性记录联合经证明的功效显示AAV是用以共同操作的良好平台。另一具有吸引力的特征是AAV相对易于操作，因为AAV是具有小型基因组(约4.7kb)和简单遗传组分–反向末端重复序列(ITR)、Rep和Cap基因的单链DNA病毒。在AAV载体中仅需要ITR和AAV衣壳蛋白，其中ITR充当用于载体产生的复制和包装信号，而衣壳蛋白通过形成衣壳以容纳载体基因组DNA，决定组织向性，以及将载体基因组DNA递送至靶标细胞中来起主要作用。已主要存在四种方式来获得AAV衣壳基因：从培养物或组织样品分离AAV，AAV定向进化，改组以及合理设计。

已显示AAV8会有效转导肝、肌肉。此外，在患有重度B型血友病的患者中，通过单次外周静脉输注达成的经AAV8介导的hFIX基因转移始终导致FIX转基因以治疗水平长期表达，而无急性或持久毒性。

AAV载体在基因转移中具有许多优势，但仍然有一些问题待解决。因此，需要更有效的AAV载体。

发明内容

在一个方面，提供一种腺相关病毒。病毒包含AAV8突变衣壳。在一个实施方案中，衣壳具有序列SEQ ID NO:18，并且被称为AAV3G1。在另一实施方案中，衣壳具有序列SEQ IDNO:20，并且被称为AAV8.T20。在另一实施方案中，衣壳具有序列SEQ ID NO:22，并且被称为AAV8.TR1。在另一方面，提供一种编码如本文所述的衣壳的核酸。在一个实施方案中，衣壳由SEQ ID NO:17或与其共有至少95％同一性的序列编码。在另一实施方案中，衣壳由SEQID NO:19或与其共有至少95％同一性的序列编码。在另一实施方案中，衣壳由SEQ ID NO:21或与其共有至少95％同一性的序列编码。

在另一实施方案中，包括AAV8突变衣壳的AAV至少包括vp3衣壳，其相较于天然AAV8(SEQ ID NO:34)在以下区域中的至少一个中具有突变：i.氨基酸263至267(SEQ IDNO:78)；ii.氨基酸457至氨基酸459；iii.氨基酸455至氨基酸459(SEQ ID NO:81)；或iv.氨基酸583至氨基酸597(SEQ ID NO:69)。在一个实施方案中，相较于AAV8，具有AAV8突变衣壳的AAV在靶标组织中具有增加的转导。在一个实施方案中，靶标组织是肌肉、肝、肺、气道上皮、神经元、眼或心脏。在另一实施方案中，相较于天然AAV8，具有AAV8突变衣壳的AAV具有增加的逃脱AAV中和抗体的能力。

在一个实施方案中，vp1和/或vp2独特区域源于与提供vp3独特区域的AAV(即AAV8)不同的AAV。在一个实施方案中，提供vp1和vp2序列的AAV是rh.20。在一个实施方案中，rh.20vp1序列是SEQ ID NO:88。

在另一实施方案中，AAV进一步包括AAV反向末端重复序列和异源性核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至指导由所述异源性核酸序列编码的产物在靶标细胞中表达的调控序列。